Химический компонент гибкой трубы из нержавеющей стали 310 10 * 1 мм. N-концевые домены спидроина образуют гидрогели на основе амилоидных фибрилл и обеспечивают платформу для иммобилизации белков.

Благодарим вас за посещение Nature.com.Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Слайдеры, показывающие по три статьи на слайде.Используйте кнопки «Назад» и «Далее» для перемещения по слайдам или кнопки контроллера слайдов в конце для перемещения по каждому слайду.

Спецификация

310 поставщиков колтюбинговых труб из нержавеющей стали диаметром 10*1 мм

Химический состав

Механические свойства

Рекомбинантные белки паучьего шелка (белки паучьего шелка) имеют множество потенциальных применений при разработке новых биоматериалов, но их мультимодальная и склонная к агрегации природа затрудняет их получение и упрощает использование.Здесь мы сообщаем, что рекомбинантные миниатюрные спидроиновые белки и, что важно, сам N-концевой домен (NT) быстро образуют самоподдерживающиеся и прозрачные гидрогели при 37 ° C.слитые белки, состоящие из NT и зеленого флуоресцентного белка или пуриннуклеозидфосфорилазы, образуют полностью функциональные слитые белки.Гидрогели.Наши результаты показывают, что рекомбинантные NT и слитые белки обеспечивают высокий выход экспрессии и наделяют гидрогели привлекательными свойствами, такими как прозрачность, гелеобразование без сшивки и прямая иммобилизация активных белков при высокой плотности.
У пауков целых семь различных наборов шелковых желез, каждый из которых производит определенный тип шелка.Все семь видов шелка состоят из белков паучьего шелка (спидроинов) длиной примерно 6000 остатков и содержат большую центральную область повторов, окруженную сферическими N- и C-концевыми доменами (NT и CT)1,2.Наиболее широко изученный тип шелка — первичная ампула — вырабатывается первичной ампулальной железой.В этой железе монослой эпителиальных клеток синтезирует спидроиновые белки и секретирует их в просвет железы, где они присутствуют в растворимой форме (допинг) в чрезвычайно высоких концентрациях (30–50% мас./об.)3,4.Организация и конформация основных ампулярных спидроиновых белков в железе обсуждаются, но большинство экспериментальных данных указывает на наличие в целом спиральной и/или случайной спиральной конформации, а также мицеллярных или ламеллярных структур5,6,7,8,9,10.В то время как повторяющиеся домены регулируют механические свойства шелковых волокон, образуя нанокристаллы β-листов и аморфные структуры11,12,13,14,15, концевые домены регулируют шелковые волокна в ответ на изменение условий вдоль шелковой железы16,17,18.Контролируя образование шелка, 19. Концевые домены эволюционно консервативны, и их функция может быть общей для всех спидроиновых белков 2,20,21.Во время прохождения через железу pH спидроина снижается примерно с 7,6 до <5,716 и увеличивается при сдвиге и растяжении, опосредованном движением через постепенно сужающийся проток.В растворе CT представляет собой α-спиральный конститутивный параллельный димер17, но в ответ на низкий pH и силы сдвига CT разворачивается и переключает β-слои16, 17, возможно, запуская β-слои в повторяющихся областях Convert 16. NT являются мономерными при условиях, отражающих условия в просвете железы и опосредующих растворимость спидроина, но при пониженном pH протонирование ряда боковых цепей карбоновых кислот приводит к димеризации НТ с рКа примерно 6,5, тем самым стабилизируя НТ и фиксируя спидроин в больших количествах. количества.сети16,18.Таким образом, НТ играет ключевую роль в формировании нитей, превращаясь из мономера в покрытии в димер в волокне23,24,25.NT остается высокорастворимым и спиральным во всех изученных на сегодняшний день условиях16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, что послужило толчком к его разработке в качестве метки, повышающей растворимость, для производства гетерологичных белков.
Рекомбинантный мини-белок шелка паука, состоящий из одного NT, одной области коротких повторов, одного CT и метки His6 (His-NT2RepCT) для очистки, так же растворим в водном буфере, как и нативный белок шелка паука, и имитирует нативные важные характеристики шелкового паука. .освещение 25.31.His-NT2RepCT можно формовать в непрерывные волокна с использованием биомиметической машины, в которой растворимое покрытие с pH 8 экструдируется в водяную баню с pH 525,32,33,34,35.Биореакторная ферментация E. coli, экспрессирующая His-NT2RepCT, и последующая последующая обработка привели к выходу> 14 г/л после очистки.Высокий выход, высокая растворимость и адекватная реакция His-NT2RepCT на кислые условия приписываются NT23, 25, 34.
Здесь мы сообщаем о быстром образовании прозрачных гидрогелей из рекомбинантных спидроиновых белков, включая только NT, путем инкубации белкового раствора при 37 ° C.Используя флуоресценцию тиофлавина Т (ThT), инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье (FTIR), спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и трансмиссионную электронную микроскопию (ТЕМ), мы обнаружили, что NT и белки микропауков подвергаются структурной трансформации в β-листы и амилоидные фибриллы. когда образуются гели.Кроме того, слитые белки NT и зеленого флуоресцентного белка (GFP) или пуриннуклеозидфосфорилазы (PNP) образуют гидрогели с полностью функциональными слитыми фрагментами.Высокопроизводительная экспрессия у гетерологичных хозяев в сочетании с быстрым образованием гидрогелей в физиологических условиях открывает возможность экономически эффективного производства гидрогелей с инженерными функциями.
В отличие от большинства известных рекомбинантных спидроиновых белков36, His-NT2RepCT стабилен в трис-HCl-буфере при pH 8 и может быть сконцентрирован до 500 мг/мл без осаждения25.Поэтому мы были удивлены, обнаружив, что этот белок быстро образует оптически прозрачные самоподдерживающиеся гидрогели при инкубации при 37°C (рис. 1б-г).Дальнейшие исследования показали, что гелеобразование His-NT2RepCT происходит в широком диапазоне концентраций белка (10–300 мг/мл) и что эта концентрация обратно коррелирует со временем гелеобразования (рис. 1c и дополнительный рисунок 1).Чтобы выяснить, какие части His-NT2RepCT опосредуют образование гидрогеля, мы затем исследовали каждый домен индивидуально и в различных комбинациях, используя анализ инверсии колбы (рис. 1a,b).Все тестируемые фракции рекомбинантного спидроина образовывали гели (при концентрации белка 300 мг/мл) менее чем за 1 ч, за исключением преципитированного 2Rep (рис. 1б).Это предполагает, что NT и CT по отдельности, в комбинации или в сочетании с повторами, могут образовывать гель при 37°C и что метка His6 не влияет на этот процесс в сколько-нибудь существенной степени.Учитывая распространенное мнение, что NT является хорошо растворимым и стабильным белком, и что предыдущие сообщения о гидрогелях рекомбинантного спидроина объясняли эффекты гелеобразования конформационными изменениями в повторяющихся областях и/или CT, сам NT мог бы это сделать.Открытие гелеобразования было неожиданным.Дополнительная таблица 1) 37, 38, 39. Примечательно, что NT уже образовывал гель в течение 10 минут при концентрации ≥ 300 мг/мл (рис. 1c).Эксперименты по инверсии флаконов с различными концентрациями NT показали, что при >50 мг/мл раствор NT гелеобразовал быстрее, чем His-NT2RepCT при соответствующей концентрации (мас./об., рисунок 1c).
Схематическое изображение различных спидроиновых конструкций, изученных в данной работе.b Время гелеобразования при 37 °C для различных рекомбинантных белков спидроина (300 мг/мл), подтвержденное переворачиванием флакона.CT-гель сразу без инкубации (<300 мг/мл), 2Rep выпадает в осадок (300 мг/мл, масштаб 5 мм).c Время гелеобразования His-NT2RepCT и NT при указанных концентрациях белка при 37°C.d Фотографии гидрогелей His-NT2RepCT и NT с напечатанными внизу пауком и буквой «NT» соответственно (оба 200 мг/мл, масштабная линейка 5 мм).
Гидрогели, образованные различными рекомбинантными белками спидроина, имеют несколько разный цвет, а наблюдение невооруженным глазом показывает различную степень прозрачности (рис. 1б).Гели NT исключительно прозрачны, в то время как другие гели становятся непрозрачными.Гели His-NT2RepCT и NT, отлитые в цилиндрические пробирки, можно было извлечь из формы в целости и сохранности (рис. 1г).
Чтобы проверить, гелеобразуют ли покрытия из натурального шелка паука в условиях, которые, как теперь установлено, вызывают гелеобразование рекомбинантных спидроиновых белков, покрытия были собраны из большой ампулальной железы шведского мостового паука (Larinioides slopetarius).Покрытия хранились в 20 мМ трис-HCl-буфере при концентрации 50 мг/мл (на основе измеренного сухого веса), но гелеобразования не наблюдалось в течение 21 дня инкубации при 37 ° C (дополнительная фигура 2a).
Для количественной оценки этих гелей можно использовать реологические измерения для изучения процесса гелеобразования и определения общих механических свойств.В частности, мониторинг модуля упругости (эластичности) при повышенных температурах может предоставить информацию о температуре гелеобразования, а также вязкоупругих свойствах покрытия.Эксперименты по повышению температуры (с использованием скорости 1°C/мин при 25-45°C, на основе предыдущих исследований с использованием исходных растворов натурального шелка)40,41 показали, что модули хранения растворов His-NT2RepCT и NT увеличиваются с повышением температуры.был увеличен (рис. 2 и дополнительный рис. 3).Примечательно, что модуль NT начал расти при более низкой температуре по сравнению с His-NT2RepCT, что соответствует более быстрому времени гелеобразования, наблюдаемому при непосредственном инкубировании NT с His-NT2RepCT при 37°C (рис. 1).После последующего падения температуры модуль упругости не вернулся к более низким значениям и оставался выше модуля потерь (см. дополнительный рисунок 3), что указывает на термически необратимое стабильное гелеобразование.После гелеобразования конечный модуль упругости составлял от 15 до 330 кПа для гидрогелей His-NT2RepCT в концентрации 100–500 мг/мл, а конечный модуль упругости для гидрогелей NT (100–500 мг/мл) – от 2 до 1400. кПа (рис. 2 и полные данные рампы) см. дополнительный рис. 3).
а Изменение температуры при измерении His-NT2RepCT (300 мг/мл) и б NT (300 мг/мл) при встряхивании.Стрелки указывают на температурный тренд, а более светлая заливка данных модуля хранения отображает испытания при меньших значениях крутящего момента для прибора, чем указано производителем, что и является причиной повышенного шума.в Накопление конечного модуля His-NT2RepCT и NT после повышения температуры (100, 300 и 500 мг/мл).Все показания модуля снимаются с частотой 0,1 Гц.
В качестве потенциального метода исследования конформационных изменений, связанных с гелеобразованием, мы записали FTIR-спектры His-NT2RepCT и NT до и после гелеобразования при 37 ° C (рис. 3a,b).Как и ожидалось, спектры растворов His-NT2RepCT и NT соответствовали белкам, имеющим вторичную структуру α-спираль/случайный клубок, с выраженной полосой при 1645 см-1.Для обоих гидрогелей гелеобразование привело к образованию двух плеч в средней I-полосе около 1617 см-1 и 1695 см-1 (рис. 3а, б), что указывает на образование антипараллельных структур β-листов.Эти изменения также можно ясно увидеть в соответствующих спектрах второй производной и разностного гелеобразования (дополнительный рисунок 4b).Две полосы β-слоя NT были более выражены, чем у His-NT2RepCT, что указывает на то, что общее содержание полос β-слоя в гидрогеле NT было выше, чем в гидрогеле NT2RepCT.
a Спектры поглощения His-NT2RepCT и b NT (оба 500 мг/мл) до (раствор) и после (гель) инкубации при 37°C.c TEM-изображения ресуспендированных гелей NT2RepCT с концентрацией 50 мг/мл и d NT.Масштабная линейка 200 нм.e Диаметры волокон гидрогелей His-NT2RepCT и NT.n = 100 измеренных фибрилл, p <0,0001.Столбики ошибок показывают стандартное отклонение.Центр полосы ошибок — это среднее значение.Для статистического анализа использовался непарный t-критерий (двусторонний).е ThT-флуоресценция различных рекомбинантных белков спидроина (100 мг/мл) при 37 °C без встряхивания.Эксперименты по инокуляции г НТ (100 мг/мл) из геля НТ 100 мг/мл с 0%, 5%, 10% и 20% семян.
Анализ геля с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) показал, что гидрогель состоит из амилоидоподобных фибрилл (рис. 3в, 3г).Фибриллы, образующиеся из NT, были удлиненными (диаметром 5–12 нм) и неразветвленными, тогда как фибриллы His-NT2RepCT были короче по длине и значительно шире в диаметре (7–16 нм) (рис. 3д).Эти результаты позволили нам проследить за кинетикой фиброза с помощью анализа тиофлавина Т (ThT).Для всех рекомбинантных белков спидроина флуоресцентный сигнал увеличивался, когда образцы инкубировали при 37 ° C (рис. 3f, дополнительный рис. 5a).В соответствии с этим выводом микроскопическое исследование NT и His-NT2RepCT в условиях гелеобразования выявило равномерное увеличение флуоресценции ThT без заметного локального накопления ThT-положительных агрегатов (дополнительные рисунки 5b, c).Образование ThT-положительных фибрилл не сопровождалось увеличением мутности NT и His-NTCT (дополнительный рисунок 5d), что означает, что сеть фибрилл в геле могла формироваться без ущерба для прозрачности геля.Посев путем добавления небольших количеств предварительно сформированных фибрилл может значительно ускорить образование фибрилл некоторых амилоидов42,43,44, но добавление 5%, 10% или 20% (по массе) НТ к раствору НТ-гидрокоагулянтов.затравочный эффект (рис. 3ж).Возможно, это связано с тем, что фибриллы в гидрогеле относительно фиксированы и не могут быть использованы в качестве затравок.
Неожиданное поведение рекомбинантных спидроиновых белков при высоких температурах побудило к дальнейшим исследованиям спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для выявления конформационных изменений, связанных с образованием геля.Спектры ЯМР растворов His-NT2RepCT, записанные с течением времени при 37°C, показали, что CT все еще был частично свернут, тогда как сигналы NT и 2Rep исчезли (рис. 4а), что позволяет предположить, что в основном NT и 2Rep частично контролировали образование His- Гидрогель NT2RepCT.Сигнал КТ также был ослаблен до 20% от его первоначальной интенсивности, что позволяет предположить, что КТ также в основном фиксирован и включен в структуру гидрогеля.Для меньшей части CT, которая столь же подвижна, как и в предварительно инкубированном образце и, таким образом, наблюдается с помощью ЯМР раствора, в спектрах отсутствуют сигналы для первых 10 структурированных остатков, возможно, из-за трудной иммобилизации присоединенной части His-NT2Rep.Спектры ЯМР -состояния гидрогелей -NT2RepCT выявили преимущественное наличие α-спиралей и β-слоев и в меньшей степени конформацию случайного клубка (рис. 4б).Анализ химического сдвига остатков метионина, присутствующих только в NT, показал, что этот домен превратился в структуру β-листа.Временные спектры НТ в растворе показали равномерное снижение интенсивности сигнала (рис. 4в), а твердотельный ЯМР гидрогелей НТ показал, что большая часть остатков НТ превратилась в структуры β-листов (рис. 4г).Конформацию 2Rep невозможно определить отдельно из-за его склонности к агрегации.Однако спектры ЯМР твердого тела гидрогелей NTCT и His-NT2RepCT выглядели очень похожими (рис. 4b; дополнительный рисунок 6b), что позволяет предположить, что 2Rep мало вносил вклад в структурную часть гидрогеля His-NT2RepCT.Для гидрогелей CT было обнаружено существование α-спиралей, β-листов и случайных спиральных вторичных структур (дополнительный рисунок 6d).Это предполагает, что некоторые части CT остаются α-спиралями, а другие становятся β-листами.Таким образом, результаты ЯМР-спектроскопии позволяют предположить, что НТ важен для образования гидрогеля, а также трансформируется в конформацию β-листа при слиянии с 2Rep и CT.В соответствии с этим мы недавно обнаружили, что амилоидные пространственные молнии, вероятно, образуются во всех пяти спиралях NT-домена, а алгоритм Вальца предсказал амилоидогенную область в спирали 1 (Рис. 4e).
Двумерные спектры раствора 15N-HSQC 10 мг/мл His-NT2RepCT до (синий) и через 19 часов после инкубации (красный) при 37°C.Отдельные перекрестные пики в красном спектре и F24, G136, полиА в синем спектре обозначены однобуквенными символами аминокислот и номерами остатков.На вставках показана зависимость интенсивности сигнала от времени для выбранных остатков доменов NT, 2Rep и CT.б Твердотельные радиочастотные спектры (RFDR) гидрогелей His-NT2RepCT.Корреляции остатков Cα/Cβ, наблюдаемые в спектрах RFDR, определялись путем сравнения с модельными химическими сдвигами пептидов и значениями, полученными из статистики82,83 и их вторичных структур.SSB – вращающаяся боковая полоса.в Одномерные спектры раствора 15N-HSQC 10 мг/мл NT во время инкубации при 37 °C в течение 36 часов.На вставке показана зависимость объемной интенсивности от времени.г Твердотельные радиочастотные спектры НТ-гидрогелей.Указаны корреляции остатков Cα/Cβ и их вторичных структур, наблюдаемые в спектрах RFDR.e На основе профиля предрасположенности к фибрилляции NT45.79 из базы данных Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Розетта-энергия окна пространственного молниеносного сдвига гексапептида показана в ккал/моль.Красные столбцы обозначают гексапептиды с высокой склонностью к фиброзу (энергия Розетты ниже -23 ккал/моль; ниже пунктирной линии).Зеленые столбцы обозначают фрагменты с энергией Розетты выше порога и, следовательно, с меньшей вероятностью образуют стерические молнии.Из анализа исключали фрагменты, содержащие пролин (без колонок).Квадраты обозначают области амилоидоза, предсказанные алгоритмом Вальца81 (https://waltz.switchlab.org).Последовательность аминокислотных остатков NT находится вверху, а типы остатков, обнаруженных во вторичной структуре β (определенные методом твердотельной ЯМР-спектроскопии), показаны красным.Позиции пяти α-спиралей NT обозначены как (H1-H5)28.
При pH <6,5 HT димеризуется, будучи устойчивым к денатурации, вызванной нагреванием или мочевиной18.Чтобы выяснить, как димеризация и стабильность NT влияют на гелеобразование, растворы, содержащие 100 мг/мл NT, контролировали при pH 8, 7 и 6 с помощью теста на переворачивание флакона.Образцы NT, инкубированные при pH 8 и 7, превратились в гель через 30 минут при 37 ° C, но гель с pH 8 оставался прозрачным, тогда как гель с pH 7 демонстрировал видимый осадок (рис. 5а).Напротив, раствор, содержащий ГТ при pH 6, не образовывал гель, и через 20 мин при 37°C можно было увидеть крупный осадок.Это говорит о том, что сами димеры и/или их более высокая стабильность по сравнению с мономерами предотвращают гелеобразование.Образование осадка НТ при рН 7 и 6 не ожидалось, поскольку сообщалось, что НТ растворим при 200 мг/мл27, легко рефолдируется после тепловой денатурации, а также сохраняет α-спираль при более низких значениях pH 18. Вероятным объяснением этих расхождений является то, что ранее опубликованные эксперименты проводились при комнатной температуре или ниже или при относительно низких концентрациях белка16,18,19.
Тест на инверсию флакона NT (100 мг/мл) при pH 8, 7, 6 и 154 мМ NaCl (pH 8) после инкубации при 37°C.б Спектры NT КД с 154 мМ NaF и 154 мМ NaCl и без них соответственно.Молярная эллиптичность при 222 нм преобразуется в долю естественных складок.c Анализ инверсии NT (100 мг/мл) NT* (37 °C и 60 °C), NTA72R (37 °C) и His-NT-L6 (37 °C и 60 °C).г Спектры КД NT-мутантов NT*, NTA72R и His-NT-L6.Молярная эллиптичность при 222 нм преобразуется в долю естественных складок.e Тест на инверсию NTFlSp, NTMiSp и восстановленного NTMiSp (100 мг/мл).Масштабная линейка 5 мм.е Спектры КД NT, NTFlSp, NTMiSp и восстановленного NTMiSp.Молярная эллиптичность при 222 нм преобразуется в долю естественных складок.Полные спектры NT при 25 ° C и 95 ° C показаны на дополнительном рисунке 8.
Физиологическая концентрация соли определяет электростатические взаимодействия между субъединицами NT и димеризацию перехода NT к более низкому pH18.Мы обнаружили, что присутствие 154 мМ NaCl и NaF действительно ингибирует гелеобразование соответственно (рис. 5a, b; дополнительный рисунок 2b) и что эти соли повышают термическую стабильность мономеров NT (рис. 5b, дополнительный рисунок 8). .Это также предполагает, что повышение стабильности, а не димеризация, предотвращает образование геля.
Для дальнейшего изучения роли димеризации и стабильности белка в гелеобразовании мы использовали два мутанта, NT* и NTA72R, которые также остаются мономерными при низком pH 28,30.NT* представляет собой мутант с двойным переворотом заряда, у которого кажущееся диполярное распределение заряда мономера сплющено, что предотвращает димеризацию и резко увеличивает стабильность мономера.NTA72R представляет собой заряженный диполь, но Arg-замещенный Ala расположен на границе димера, поэтому мутации мешают взаимодействиям субъединиц, необходимым для димеризации.При инкубации при 37°C NT* не образовывал гидрогель, тогда как NTA72R образовывал непрозрачный гель в течение 15 мин (рис. 5в).Поскольку и NT*, и NTA72R не могут димеризоваться, но различаются по стабильности мономера (рис. 5г), эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что высокая термодинамическая стабильность предотвращает гелеобразование NT.В пользу этого говорит и тот факт, что ГТ* образует гель, когда он нестабилен при высокой температуре (через 8 мин при 60°С; рис. 5в).Ранее было показано, что высокое содержание метионина в NT разжижает его естественную укладку и что шесть заменителей Met на Leu (называемых здесь His-NT-L6) сильно стабилизируют мономер NT46.Основываясь на предположении, что для образования геля NT необходима структурная гибкость, мы обнаружили, что стабильный мутант His-NT-L6 не образовывал гель при 37 ° C (рис. 5c, d).Однако His-NT-L6 также образовывал гель при инкубации при 60°С в течение 60 мин (рис. 5в).
Способность NT трансформироваться в структуры β-листов и образовывать гидрогели, по-видимому, применима к некоторым, но не ко всем NT-доменам спидроина.НТ из разных типов шелка и видов пауков, Trichonephila clavipes (NTFlSp), образовывали гели, несмотря на относительно низкое содержание метионина и высокую термическую стабильность (рис. 5e, f и дополнительная таблица 2).Напротив, NT из небольшого ампулярного белка спидроина Araneus ventricosus (NTMiSp) с низкой термостабильностью и высоким содержанием метионина не образовывали гидрогели (дополнительная таблица 2 и рис. 5e, f).Последнее может быть связано с наличием внутримолекулярных дисульфидных связей29,47.Соответственно, когда дисульфидные связи NTMiSp были восстановлены, он образовывал гидрогель после инкубации при 37 ° C в течение 10 минут (рис. 5e).В заключение следует отметить, что структурная гибкость является важным, но не единственным критерием формирования геля из НТ.Другим фактором, который может иметь значение, является склонность к образованию амилоидных фибрилл, а анализ с использованием базы данных застежек-молний и алгоритма Вальса действительно показал корреляцию между способностью образовывать гели и наличием амилоидогенных областей, а также размером прогнозируемых областей. для формирования стерических молний.Имела место корреляция (дополнительная таблица 2 и дополнительный рисунок 9).
Способность NT образовывать фибриллы и гели в благоприятных условиях привела нас к гипотезе, что слияния NT с другими белковыми фрагментами все еще могут образовывать гели с полной функцией партнеров слияния.Чтобы проверить это, мы ввели зеленый флуоресцентный белок (GFP) и пуриннуклеозидфосфорилазу (PNP) на С-конец NT соответственно.Полученные слитые белки экспрессировались в E. coli с очень высокими конечными выходами (культуры во встряхиваемых колбах с концентрацией 150 мг/л и 256 мг/л для His-NT-GFP и His-NT-PNP соответственно), что согласуется с тем, что было показано. для других белков, слитых с NT Ref.30. Слитые белки His-NT-GFP (300 мг/мл) и His-NT-PNP (100 мг/мл) образовывали гели через 2 часа и 6,5 часов при 37°C и, что важно, фракция GFP оставалась неизменной.наблюдается после гелеобразования, при этом после гелеобразования остается >70% исходной интенсивности флуоресценции (рис. 6а).Для измерения активности PNP в растворах и гелях his-NT-PNP нам пришлось разбавить слитый белок NT, поскольку ферментативная активность чистого препарата находилась за пределами диапазона обнаружения анализа при гелеобразующих концентрациях.Гель, образованный смесью, содержащей 0,01 мг/мл His-NT-PNP и 100 мг/мл NT, сохранял 65% исходной ферментативной активности предварительно инкубированных образцов (рис. 6б).Гель оставался неповрежденным во время измерения (дополнительный рисунок 10).
a Относительная интенсивность флуоресценции до и после гелеобразования His-NT-GFP (300 мг/мл) и перевернутого флакона, содержащего гидрогель His-NT-GFP (300 мг/мл), в видимом и УФ-свете.Точки показывают отдельные измерения (n = 3), полосы ошибок показывают стандартное отклонение.Среднее значение показано в центре полосы погрешностей.b Активность ПНП определяли флуорометрическим анализом с использованием растворов и гелей, состоящих из НТ (100 мг/мл) и смеси, содержащей 0,01 мг/мл гис-НТ-ПНП и 100 мг/мл новотайваньских долларов.На вставке показан перевернутый флакон, содержащий гидрогель, содержащий His-NT-PNP (шкала 5 мм).
Здесь мы сообщаем об образовании гидрогелей из NT и других рекомбинантных спидроиновых белков путем инкубации белкового раствора при 37 ° C (рис. 1).Мы показываем, что гелеобразование связано с трансформацией α-спиралей в β-слои и образованием амилоидоподобных фибрилл (рис. 3 и 4).Это открытие является удивительным, поскольку НТ представляют собой скрученные глобулярные пучки из пяти спиралей, известные своей чрезвычайно высокой растворимостью и высокой стабильностью при концентрациях > 200 мг/мл при 4°C в течение нескольких дней27.Кроме того, НТ легко рефолдируются после тепловой денатурации при низких концентрациях белка в мкМ.Согласно нашим результатам, для образования фибрилл необходимо сочетание концентрации белка >10 мг/мл и слегка повышенной температуры (рис. 1).Это согласуется с идеей, что амилоидные фибриллы могут образовываться из глобулярно свернутых белков, которые находятся в частично развернутом состоянии из-за тепловых флуктуаций в физиологических условиях 48 .Примеры белков, которые подвергаются этому преобразованию, включают инсулин49,50, β2-микроглобулин, транстиретин и лизоцим51,52,53.Хотя NT в нативном состоянии представляет собой α-спираль, примерно 65% полипептидной цепи совместимо с образованием стерической молнии (Рис. 4e) 45 .Поскольку мономер динамически подвижен46, он может обнажать эти потенциальные амилоидогенные области при умеренно повышенных температурах, а при высоких концентрациях общего белка может достигать критической концентрации для образования амилоидных фибрилл54.Следуя этим рассуждениям, мы обнаружили отрицательную корреляцию между концентрацией спидроина и временем гелеобразования (рис. 1в), и если конформация мономерного NT стабилизирована либо мутациями (NT*, His-NT-L6), либо добавлением соли, это может предотвратить образование гидрогелей (рис. 5).
В большинстве случаев амилоидные фибриллы исчезают из раствора в виде осадка, но при определенных условиях они могут образовывать гидрогели55,56,57.Фибриллы, образующие гидрогель, обычно имеют высокое соотношение сторон и образуют стабильные трехмерные сети за счет молекулярного перепутывания,55,58 что согласуется с нашими результатами.Для формирования гидрогелей in vitro белки часто полностью или частично разворачиваются, например, под воздействием органических растворителей, высокой температуры (70–90°C) и/или низкого pH (1,5–3,0)59,60,61,62.Описанные здесь спидроиновые гидрогели не требуют жесткой обработки и сшивающих агентов для стабилизации гидрогелей.
Ранее сообщалось, что спидроиновые повторы и КТ, которые, по-видимому, подвергаются переключению β-листов во время прядения шелка, образуют гидрогели.По сравнению с нашими результатами, время инкубации и/или температура инкубации были значительно дольше или выше, соответственно, а полученные гидрогели часто были непрозрачными (рис. 7 и дополнительная таблица 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68. , 69. Помимо быстрого времени гелеобразования, гидрогели NT >300 мг/мл (30%) превосходили все другие описанные гидрогели из рекомбинантного белка шелка паука, а также природные гидрогели, такие как желатин, альгинат (2%), агар (0,5%). ) и коллаген.(0,6%) (рис. 7 и дополнительные таблицы 1 и 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Время гелеобразования и модуль упругости гидрогелей в этом исследовании сравнивались с другими гидрогелями на основе спидроина и выбранными природными гидрогелями.Ссылки даны вместе с описанием условий гелеобразования.APS Персульфат аммония, комнатная температура.Данные 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Похоже, пауки разработали способы предотвращения гелеобразования спидроина во время хранения.Несмотря на высокую концентрацию белка в шелковой железе, большая область повторов, связанная с терминальным доменом, означает, что кажущаяся концентрация NT и CT в железе соответствует примерно 10-20 мг/мл на границе этого исследования.необходим для наблюдаемого in vitro образования гидрогеля.Кроме того, аналогичные концентрации солей 16 стабилизировали NT, как и в шелковых железах (рис. 5б).Конформация NT была изучена в цитозоле E. coli и оказалась более плотно свернутой, чем при исследовании in vitro, что дополнительно указывает на то, что соль или другие факторы предотвращают ее агрегацию in vivo.Однако способность NT трансформироваться в фибриллы β-листов может быть важна для формирования филаментов и должна быть изучена в будущих исследованиях.
В дополнение к новым аспектам формирования NT-амилоидных фибрилл и гидрогелей, наблюдаемым в этом исследовании, мы также показываем, что это явление может иметь биотехнологические и биомедицинские применения (рис. 8).В качестве доказательства концепции мы объединили NT с GFP или PNP и показали, что слитый белок также образует гидрогели при инкубации при 37 ° C и что фракции GFP и PNP в значительной степени сохраняют свою активность после гелеобразования (рис. 6).Нуклеозидфосфорилазы являются важными катализаторами синтеза аналогов нуклеозидов75, что делает наше открытие актуальным для биофармацевтической промышленности.Концепция экспрессии слитых белков, которые образуют прозрачные гидрогели в благоприятных условиях, позволяет создавать функционализированные гидрогели с благоприятными свойствами для широкого спектра применений, таких как иммобилизация ферментов, контролируемое высвобождение лекарств и тканевая инженерия.Кроме того, NT и NT* являются эффективными маркерами экспрессии30, а это означает, что NT и его варианты можно использовать для высокопроизводительного производства растворимых слитых белков и последующего создания иммобилизованных белков-мишеней в 3D-гидрогелях.
NT растворим, α-спирален и стабилен при низких концентрациях (мкМ) и 37°C.При той же температуре, но при возрастающих концентрациях (>10 мг/мл) НТ образует гели, состоящие из амилоидоподобных фибрилл.Слитые белки NT также образуют фибриллярные гели с полностью функциональными слитыми фрагментами, что позволяет иммобилизовать различные белки в трехмерных гидрогелях с использованием NT.Внизу: NT (PDB: 4FBS) и иллюстрации волоконных сетей и связанных с ними белковых структур (предположительно, но не в масштабе, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Конструкции (полный список, включая аминокислотные последовательности, см. в дополнительной таблице 4) клонировали в плазмиду pT7 и трансформировали в E. coli BL21 (DE3).E. coli, содержащую сконструированные плазмиды, инокулировали в бульон Луриа с добавлением канамицина (70 мг/л) и выращивали в течение ночи при 30°C и 250 об/мин.Затем культуру инокулировали в соотношении 1/100 в среду LB, содержащую канамицин, и культивировали при 30°C и 110 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигала 0,8.Для ЯМР-исследований бактерии выращивали на минимальной среде М9, содержащей 2 г D-глюкозы 13С (Aldrich) и 1 г хлорида аммония 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) для мечения белков изотопами.Понизьте температуру до 20 градусов Цельсия и индуцируйте экспрессию белка с помощью 0,15 мМ изопропилтиогалактопиранозида (конечная концентрация).После экспрессии белка в течение ночи клетки собирали при 7278×g, 4°C в течение 20 минут.Осадки клеток ресуспендировали в 20 мМ трис-HCl, pH 8, и замораживали до дальнейшего использования.Размороженные клетки лизировали с использованием устройства для разрушения клеток (машины серии TS, Constant Systems Limited, Англия) при давлении 30 кПа.Затем лизаты центрифугировали при 25000 g в течение 30 минут при 4°С.Для NTMiSp осадок затем ресуспендировали в 2 М мочевины, 20 мМ Трис-HCl, pH 8, и обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут (2 с вкл/выкл, 65%), затем снова центрифугировали при 25000 g, 4°C в течение 30 минут.Супернатант загружали на колонку Ni-NTA, промывали 20 мМ Трис-HCl, 2 мМ имидазола, pH 8, и, наконец, белок элюировали 20 мМ Tris-HCl, 200 мМ имидазола, pH 8. Для создания NT2RepCT и NTCT, расщепление тромбина приводит к появлению сайта (ThrCleav) между His и NT.Сайты расщепления тромбина также присутствуют в His-NT-ThrCleav-2Rep (продуцирует 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (продуцирует NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (продуцирует CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT. .* (продуцирует NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (продуцирует NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (продуцирует NTF1Sp) и His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (продуцирует NTMiSp).Конструкции расщепляли тромбином (1:1000) и диализовали в течение ночи при 4°C с 20 мМ Tris-HCl, pH 8, используя диализную мембрану Spectra/Por с порогом молекулярной массы 6-8 кДа.После диализа раствор загружают в колонку Ni-NTA и собирают сточные воды, содержащие интересующий белок.Концентрации белков определяли путем измерения УФ-поглощения при 280 нм с использованием коэффициента экстинкции каждого белка, за исключением NTF1Sp, для чего использовали анализ Брэдфорда в соответствии с протоколом производителя.Чистоту определяли электрофорезом в полиакриламидном геле с ДСН (4–20%) и окрашиванием Кумасси бриллиантовым синим.Белки концентрировали с использованием центрифужных фильтров (VivaSpin 20, GE Healthcare) при 4000 g с порогом молекулярной массы 10 кДа в 20-минутных циклах.
Разморозьте белковый раствор и осторожно перелейте 150 мкл в флакон с прозрачной мембраной емкостью 1 мл (8 x 40 мм Thermo Scientific).Пробирки закрывали крышками и запечатывали парафильмом для предотвращения испарения.Образцы (n = 3) инкубировали при 37°С или 60°С и периодически переворачивали для наблюдения за гелеобразованием.Образцы, которые не образовали гель, инкубировали в течение по меньшей мере одной недели.Уменьшите дисульфидные связи NTMiSp с помощью 10 мМ DTT на 10 мкМ белка.Для анализа гелеобразования покрытий из натурального паучьего шелка шведского мостового паука разрезали, две основные ампулированные железы помещали в 200 мкл 20 мМ Трис-HCl-буфера, pH 8, и разрезали, чтобы позволить покрытию отделиться от желез..Содержимое желез растворяют в буфере по 50 мкл для определения сухой массы (путем инкубации открытых флаконов при 60 °С до постоянной массы) и 150 мкл для гелеобразования при 37 °С.
Измерительная геометрия/инструмент изготовлены из нержавеющей стали с использованием параллельной пластины с верхним диаметром 20 мм и зазором 0,5 мм.Нагрейте образец от 25 °C до 45 °C и обратно до 25 °C со скоростью 1 °C в минуту, используя нижнюю пластину Пельтье из нержавеющей стали.Вибрационные измерения проводились на частоте 0,1 Гц и в линейно-вязкоупругой области материала при деформации 5 % и 0,5 % для образцов 100 мг/мл и 300–500 мг/мл соответственно.Используйте специальную камеру влажности, чтобы предотвратить испарение.Данные были проанализированы с использованием Prism 9.
Для сбора инфракрасных (ИК) спектров при комнатной температуре от 800 до 3900 см–1.Устройство НПВО, а также путь света через спектрометр продуваются сухим фильтрованным воздухом до и во время эксперимента.Растворы (500 мг/мл для минимизации пиков поглощения воды в спектрах) наносили пипеткой на кристаллы, а гели (500 мг/мл) формировали перед измерением и затем переносили на кристаллы (n = 3).Было записано 1000 сканирований с разрешением 2 см-1 и нулевым рабочим циклом 2. Вторая производная рассчитывалась с помощью OPUS (Bruker) с использованием диапазона сглаживания в девять точек.Спектры были нормализованы к одной и той же области интегрирования между 1720 и 1580 см-1 с использованием программы Ф. Менгеса «Spectragryph – Optical Spectrocracy Software».В НПВО-ИК-спектроскопии глубина проникновения инфракрасного луча в образец зависит от волнового числа, что приводит к более сильному поглощению при более низких волновых числах, чем при более высоких волновых числах.Эти эффекты не были учтены для спектров, представленных на рис.3, потому что они очень малы (дополнительный рисунок 4).Скорректированные спектры для этого рисунка были рассчитаны с использованием программного обеспечения Bruker OPUS.
В принципе, комплексная количественная оценка конформаций белка возможна после надежной деконволюции компонентов в пределах пика амида I.Однако на практике возникают некоторые препятствия.Шум в спектре может проявляться в виде (ложных) пиков во время деконволюции.Кроме того, пик изгиба воды совпадает с положением пика амида I и может иметь аналогичную величину для образцов, содержащих большое количество воды, таких как исследованный здесь водный гель.Поэтому мы не пытались полностью разложить пик амида I, и наши наблюдения следует рассматривать только в поддержку других методов, таких как ЯМР-спектроскопия.
Растворы 50 мг/мл NT и His-NT2RepCT гелировали в течение ночи при 37°C.Затем гидрогель разбавляли 20 мМ трис-HCl (рН 8) до концентрации 12,5 мг/мл, хорошо встряхивали и пипетировали, чтобы разрушить гель.Далее гидрогель разбавляли в 10 раз 20 мМ Трис-HCl (рН 8), 5 мкл образца наносили на медную сетку, покрытую формваром, излишек образца удаляли промокательной бумагой.Образцы дважды промывали 5 мкл воды MilliQ и окрашивали 1% формиатом уранила в течение 5 минут.Удалите излишки пятна впитывающей бумагой, затем высушите сетку на воздухе.Визуализация этих сеток выполнялась с использованием FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, работающего при 100 кВ.Изображения были записаны с увеличением x 26 500 и x 43 000 с использованием CCD-камеры Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Мюнстер, Германия).Для каждого образца (n = 1) записывали 10–15 изображений.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) использовался для анализа изображений и измерения диаметров волокон (n = 100, разные волокна).Призма 9 использовалась для выполнения непарных t-тестов (двусторонних).Средняя длина фибрилл His-NT2RepCT и NT составляла 11,43 (SD 2,035) и 7,67 (SD 1,389) нм соответственно.Доверительный интервал (95%) составляет от -4,246 до -3,275.степени свободы = 198, р <0,0001.
80 мкл жидких образцов, содержащих 10 мкМ тиофлавина Т (ThT), измеряли в трех экземплярах (n = 3) в статических условиях с использованием 96-луночных планшетов Corning с черным дном и прозрачным дном (Corning Glass 3881, США).Различия флуоресценции регистрировали с использованием фильтра возбуждения 440 нм и фильтра эмиссии 480 нм (FLUOStar Galaxy от BMG Labtech, Оффенбург, Германия).Сигнал ThT не был ни насыщенным, ни подавленным, поскольку эксперименты с различными концентрациями ThT проводились без изменения интенсивности сигнала.Запишите поглощение при длине волны 360 нм для измерения мутности.Для экспериментов по посеву гели с концентрацией 100 мг/мл образовывали при 37°C, ресуспендировали и использовали для посева при молярных соотношениях 5%, 10% и 20%.Данные были проанализированы с использованием Prism 9.
Оттаивайте запасы His-NT2RepCT и NT > 100 мг/мл на льду и фильтруйте через фильтр 0,22 мкм.Концентрации рассчитывали путем измерения оптической плотности при 280 нм с использованием Nanodrop.В лунках 96-луночного черного несвязывающего планшета (Corning) с прозрачным дном образцы разбавляли до 20 мг/мл в 20 мМ Трис-HCl, pH 8, и смешивали с 5 мкМ ThT (конечная концентрация), общая концентрация образца. Объем 50 мкл.Образцы визуализировались каждые 10 минут при 37 °C на микроскопе CellObserver (Zeiss) с каналом проходящего света и наборами фильтров возбуждения и излучения FITC для визуализации ThT.Для визуализации используется объектив 20x/0,4.Для анализа изображений использовались Zen Blue (Zeiss) и ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Гели также готовили из растворов NT и His-NT2RepCT в концентрации 50 мг/мл, содержащих 20 мМ Трис, pH 8 и 5 мкМ ThT, и инкубировали при 37°С в течение 90 мин.Кусочки геля переносили в новую лунку, содержащую 20 мМ Трис, pH 8 и 5 мкМ ThT, в не связывающемся черном 96-луночном планшете с прозрачным дном.Получите зеленую флуоресценцию и изображения светлого поля при увеличении 20x/0,4.ImageJ использовался для анализа изображений.
Спектры ЯМР раствора получали при 310 К на спектрометре Bruker Avance Neo с частотой 600 МГц, оснащенном криозондом с квадрупольным резонансом и импульсным градиентным полем QCI (HFCN).Образцы ЯМР, содержащие 10 мг/мл гомогенного белка, меченного 13C, 15N, растворенного в 20 мМ трис-HCl (рН 8), 0,02% (мас./об.) NaN3, 5% DO (об./об.), (n = 1) .Химические сдвиги NT2RepCT при pH 6,7 использовали для отнесения пика 23 в 2D-спектре 15N-HSQC.
Спектры твердого тела ЯМР (MAS) со вращением под магическим углом гидрогелей, меченных 13C, 15N, записывали на спектрометре Bruker Avance III HD при частоте 800 МГц, оснащенном безэлектронным зондом 13C/15N{1H} диаметром 3,2 мм.Температуру образца контролировали с помощью газового потока переменной температуры при 277 К. Спектры двумерного дипольного вращательного резонанса (DARR)76 и радиочастотного пересоединения (RFDR)77 были получены на частотах MAS 12,5 кГц и 20 кГц соответственно.Кросс-поляризация (КП) от 1H до 13C осуществлялась с использованием линейного изменения частоты от 60,0 до 48,0 кГц при 1H, 61,3/71,6 кГц при 13C (при 12,5/20 кГц MAS) и времени контакта 0,5–1 мс.При сборе данных использовалась развязка Spinal6478 на частоте 73,5 кГц.Время сбора данных составляло 10 миллисекунд, а задержка цикла — 2,5 секунды.Односвязные корреляции Cα/Cβ, наблюдаемые в спектрах RFDR, были отнесены на основе характерных химических сдвигов остаточного типа и многосвязных корреляций в спектрах DARR.
База данных Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) использовалась для оценки тенденций флаттера и энергии Розетты для NT, NTFlSp и NTMiSp.База данных Zipper рассчитывает Rosetta Energy80, которая объединяет несколько функций свободной энергии для моделирования и анализа структуры белка.Уровень энергии -23 ккал/моль или ниже указывает на высокую склонность к фибриллированию.Более низкая энергия означает большую стабильность двух β-цепей в конформации застежки-молнии.Кроме того, алгоритм Вальса использовался для прогнозирования амилоидогенных областей в NT, NTFlSp и NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Раствор NT-белка смешивали с буфером 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) при pH 5,5 и 6,0 для снижения pH до pH 6 и 7 соответственно.Конечная концентрация белка составляла 100 мг/мл.
Измерения проводили на CD-спектрометре J-1500 (JASCO, США) с использованием кюветы объемом 300 мкл с оптическим путем 0,1 см.Белки разводили до 10 мкМ (n = 1) в 20 мМ фосфатном буфере (рН 8).Для анализа стабильности белков в присутствии соли белки анализировали в той же концентрации (n = 1) в 20 мМ фосфатном буфере (рН 8), содержащем 154 мМ NaF или NaCl соответственно.Сканирование температуры регистрировали при длине волны 222 нм от 25°С до 95°С со скоростью нагрева 1°С/мин.Долю нативно свернутых белков рассчитывали по формуле (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Кроме того, для каждого образца было записано пять спектров от 260 до 190 нм при 25°С и после нагревания до 95°С.Пять спектров были усреднены, сглажены и преобразованы в молярную эллиптичность.Данные были проанализированы с использованием Prism 9.
Интенсивность флуоресценции His-NT-GFP (300 мг/мл, 80 мкл) измеряли в трех повторах (n = 3) в 96-луночных планшетах Corning с черным прозрачным дном (Corning Glass 3881, США) в статических условиях.Измерьте образцы с помощью флуоресцентного планшет-ридера с длиной волны возбуждения 395 нм и запишите излучение при 509 нм перед гелеобразованием и через 2 часа при 37°C.Данные были проанализированы с помощью Prism 9.
Набор для анализа активности пуриннуклеозидфосфорилазы (флуориметрический метод, Sigma Aldrich) использовали в соответствии с инструкциями производителя.Для измерения активности в гелях и растворах, содержащих His-NT-PNP, смешайте 10 нг His-NT-PNP с 100 мг/мл NT до общего объема 2 мкл, поскольку гель давал сигнал выше интервала обнаружения набора.Были включены контроли для гелей и растворов без His-NT-PNP.Измерения проводились дважды (n = 2).После измерения активности реакционную смесь удаляли и гель фотографировали, чтобы убедиться, что гель остался неповрежденным во время измерения.Данные были проанализированы с использованием Prism 9.
Для получения дополнительной информации о дизайне исследования см. аннотацию исследования Nature, связанную с этой статьей.
На рисунках 1 и 2 представлены исходные данные.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f и 6, дополнительные рис.3, дополнительный рис.5а, г, дополнительный рис.6 и дополнительный рис.8. Данные Данные этого исследования размещены в базе данных Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Данные ЯМР, полученные в этом исследовании, были размещены в репозитории BMRBig под идентификатором записи bmrbig36.Структуры GFP и PNP были взяты из PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Райзинг А. и Йоханссон Дж. Прядение искусственного паучьего шелка.Национальная химическая компания.биология.11, 309–315 (2015).
Бэбб, П.Л. и др.Геном Nephila clavipes подчеркивает разнообразие генов паучьего шелка и их сложную экспрессию.Национальный Женетт.49, 895–903 (2017).