347 12,7*1,24 мм гибкая трубка из нержавеющей стали, молекулярный механизм синхронной электростатической конденсации и коагрегации α-синуклеина и тау

Благодарим вас за посещение Nature.com.Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Слайдеры, показывающие по три статьи на слайде.Используйте кнопки «Назад» и «Далее» для перемещения по слайдам или кнопки контроллера слайдов в конце для перемещения по каждому слайду.

Спецификация труб из нержавеющей стали 347

347 Колтюбинг из нержавеющей стали 12,7*1,24 мм

Наружный диаметр: наружный диаметр от 6,00 мм до наружного диаметра 914,4 мм, размеры до 24 дюймов. Обратите внимание, доступны со склада, стальные трубы размера наружного диаметра доступны со склада.

Диапазон толщины труб из нержавеющей стали 347: 0,3–50 мм, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS.
Вес: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S и т. д. (0,5–12 мм). Или нестандартный размер, который можно адаптировать по мере необходимости.

Тип: Бесшовные трубы SS 347 |SS 347 Трубы ВПВ |SS 347 Сварные трубы |SS 347 Готовые трубы |SS 347 Трубы CDW, трубы LSAW / сварные по шву / перетянутые

Форма: SS 347 Круглые трубы/трубки, SS 347 Квадратные трубы/трубки, SS 347 Прямоугольные трубы/трубки, SS 347 Спиральные трубы, SS 347 «U»-образная форма, SS 347 Катушки для торта, SS 347 Гидравлические трубы

Длина: одинарная произвольная, двойная произвольная и требуемая длина. Конец: гладкий конец, скошенный конец, с резьбой.

Торцевая защита: пластиковые колпачки |Внешняя отделка: 2B, № 4, № 1, № 8. Зеркальная отделка для труб из нержавеющей стали, отделка в соответствии с требованиями заказчика.

Состояние поставки: отожженный и травленный, полированный, яркий отожженный, холоднотянутый.

Осмотр, отчеты об испытаниях: сертификаты заводских испытаний, EN 10204 3.1, химические отчеты, механические отчеты, отчеты об испытаниях PMI, отчеты о визуальном осмотре, отчеты о проверках третьих сторон, одобренные NABL лабораторные отчеты, отчет о разрушающих испытаниях, отчеты о неразрушающих испытаниях

Упаковка: Упаковано в деревянные коробки, полиэтиленовые пакеты, стальные полосы в комплекте или по запросам клиентов.

Специальные особенности: размеры и характеристики, отличные от указанных выше, могут быть изготовлены по запросу.

Диапазон размеров труб из нержавеющей стали 347: 1/2 дюйма, внешний диаметр до 24 дюймов.

ASTM A312 347: Бесшовные и прямошовные аустенитные трубы, предназначенные для эксплуатации при высоких температурах и в условиях общей коррозии.Присадочный металл не допускается при сварке.

ASTM A358 347: Аустенитная труба, сваренная электросваркой, для эксплуатации в условиях коррозии и/или высоких температур.Обычно по этой спецификации производятся только трубы диаметром до 8 дюймов.Во время сварки допускается добавление присадочного металла.

ASTM A790 347: Бесшовные и прямошовные сварные ферритно-аустенитные (дуплексные) трубы, предназначенные для эксплуатации в условиях общей коррозии, с особым акцентом на стойкость к коррозионному растрескиванию под напряжением.

ASTM A409 347: Прямошовные или спиральношовные электросварные аустенитные легкостенные трубы большого диаметра размером от 14 до 30 дюймов со стенками Sch5S и Sch 10S для коррозионно-активных и/или высоких температур.

ASTM A376 347: Бесшовные аустенитные трубы для применения при высоких температурах.

ASTM A813 347: Одношовные, одно- или двушовные аустенитные трубы для высоких температур и общих коррозионных применений.

ASTM A814 347: Холоднодеформированные сварные аустенитные трубы для работы при высоких температурах и в условиях общей коррозии.

Химический состав труб из нержавеющей стали 347H

Механические свойства труб из нержавеющей стали 347H

Физические свойства труб из нержавеющей стали 347H

Эквивалентные марки для труб из нержавеющей стали 347H

Агрегация амилоидного альфа-синуклеина (αS) является отличительной чертой болезни Паркинсона и других синуклеинопатий.Недавно тау-белок, обычно связанный с болезнью Альцгеймера, был связан с патологией αS и, как было обнаружено, совместно локализуется во включениях, богатых αS, хотя молекулярный механизм коагрегации двух белков остается неясным.Мы сообщаем здесь, что фаза αS разделяется на жидкие конденсаты посредством электростатической комплексной конденсации с положительно заряженными полипептидами, такими как тау.В зависимости от сродства αS к поликатионам и скорости истощения валентности коагуляционной сети сгустки подвергаются быстрому гелеобразованию или коалесценции с последующей медленной агрегацией амилоида.Объединив набор передовых биофизических методов, мы смогли охарактеризовать фазовое разделение жидкость-жидкость αS/Tau и определить ключевые факторы, которые приводят к образованию гетерогенных агрегатов, содержащих оба белка в жидком белковом конденсате.
Помимо мембранных отсеков, пространственное разделение в клетках также может быть достигнуто за счет образования богатых белками жидкоподобных плотных тел, называемых биомолекулярными конденсатами или каплями, посредством процесса, известного как фазовое разделение жидкость-жидкость (LLPS).Эти капли образуются в результате многовалентных временных взаимодействий, обычно между белками или белками и РНК, и выполняют множество функций практически во всех живых системах.Большое количество белков, способных к LLP, имеют последовательности низкой сложности, которые сильно неупорядочены по своей природе и образуют биомолекулярные конденсаты3,4,5.Многочисленные экспериментальные исследования выявили гибкую, часто неупорядоченную и многовалентную природу белков, составляющих эти жидкие конденсаты, хотя мало что известно о конкретных молекулярных детерминантах, которые контролируют рост и созревание этих конденсатов до более твердых. состояние..
Новые данные подтверждают гипотезу о том, что аберрантные LLPS, управляемые белками, и трансформация капель в твердые структуры могут быть важными клеточными путями, ведущими к образованию нерастворимых токсичных агрегатов, которые часто являются признаками дегенеративных заболеваний.Многие ассоциированные с LLPS внутренне неупорядоченные белки (IDP), часто сильно заряженные и гибкие, уже давно связаны с нейродегенерацией посредством процесса агрегации амилоида.В частности, было показано, что биомолекулярные конденсаты IDP, такие как FUS7 или TDP-438, или белки с большими доменами низкой сложности, такие как hnRNPA19, стареют до гелеобразных или даже твердых форм посредством процесса, называемого псевдоожижением.сложный.к твердофазному переходу (LSPT) в зависимости от времени или в ответ на определенные посттрансляционные модификации или патологически значимые мутации1,7.
Другим IDP, связанным с LLPS in vivo, является Tau, связанный с микротрубочками нарушенный белок, чья амилоидная агрегация вовлечена в болезнь Альцгеймера10, но также недавно была вовлечена в болезнь Паркинсона (БП) и другие синаптические ядерные протеинопатии11,12,13.Было показано, что тау спонтанно диссоциирует из раствора/цитоплазмы из-за благоприятных электростатических взаимодействий14, что приводит к образованию капель, обогащенных тау, известных как электростатические коацерваты.Также было замечено, что этот тип неспецифического взаимодействия является движущей силой многих биомолекулярных конденсатов в природе15.В случае тау-белка электростатическая агрегация может образовываться путем простой агрегации, при которой противоположно заряженные области белка запускают процесс расщепления, или путем сложной агрегации посредством взаимодействия с отрицательно заряженными полимерами, такими как РНК.
Недавно α-синуклеин (αS), амилоид IDP, участвующий в БП и других нейродегенеративных заболеваниях, известных под общим названием синуклеинопатия17,18, был продемонстрирован на клеточных и животных моделях19,20, концентрированных в белковых конденсатах с жидкоподобным поведением.Исследования in vitro показали, что αS подвергается LLPS путем простой агрегации посредством преимущественно гидрофобных взаимодействий, хотя этот процесс требует исключительно высоких концентраций белка и атипично длительного времени инкубации19,21.Ключевым нерешенным вопросом остается вопрос о том, образуются ли αS-содержащие конденсаты, наблюдаемые in vivo, в результате того или иного процесса LLPS.Аналогичным образом, хотя агрегация αS-амилоида наблюдалась в нейронах при БП и других синуклеинопатиях, точный механизм, посредством которого αS подвергается внутриклеточной агрегации амилоида, остается неясным, поскольку сверхэкспрессия этого белка, по-видимому, сама по себе не запускает этот процесс.Часто требуется дополнительное клеточное повреждение, что позволяет предположить, что определенные клеточные местоположения или микроокружение необходимы для ренуклеации внутриклеточных ансамблей αS-амилоида.Одной клеточной средой, которая особенно склонна к агрегации, может быть внутренняя часть белковых конденсатов 23 .
Интересно, что αS и тау, как было обнаружено, совместно локализуются в характерных болезненных включениях у людей с болезнью Паркинсона и другими синуклеинопатиями 24,25, а эксперименты сообщили о синергических патологических отношениях между двумя белками 26,27, предполагая потенциальную связь между агрегацией αS и тау при нейродегенеративных заболеваниях.болезнь.Было обнаружено, что αS и тау взаимодействуют и способствуют агрегации друг друга in vitro и in vivo 28,29 и гетерогенные агрегаты, состоящие из этих двух белков, наблюдались в мозге пациентов с синуклеинопатиями 30 .Однако мало что известно о молекулярных основах взаимодействия αS и тау и механизме его коагрегации.Сообщалось, что αS взаимодействует с тау посредством электростатического притяжения между сильно отрицательно заряженной С-концевой областью αS и центральной богатой пролином областью тау, которая также обогащена положительно заряженными остатками.
В этом исследовании мы показываем, что αS действительно может диссоциировать на капли посредством конденсации электростатического комплекса в присутствии тау-белка, в отличие от его взаимодействия с другими положительно заряженными полипептидами, такими как поли-L-лизин (pLK), и в этом процессе.αS действует как каркасная молекула для капельной сети.Мы выявили заметные различия в процессе созревания электростатических αS-коацерватов, которые связаны с различиями в валентности и силе взаимодействия белков, участвующих в коацерватной сети.Интересно, что мы наблюдали совместную агрегацию белков αS и тау-амилоида в долгоживущих жидких коацерватах и ​​идентифицировали некоторые ключевые факторы, которые приводят к совместной агрегации этих двух белков в таких коацерватах.Здесь мы подробно описываем этот процесс, который является возможным молекулярным механизмом, лежащим в основе колокализации двух белков в включениях, специфичных для заболевания.
αS имеет сильно анионный С-концевой хвост при нейтральном pH (рис. 1а), и мы предположили, что он может подвергаться LLPS за счет конденсации электростатических комплексов с поликатионными неупорядоченными полипептидными молекулами.Мы использовали поли-L-лизин (pLK) из 100 остатков в качестве исходной модельной молекулы из-за ее положительно заряженной и неупорядоченной полимерной природы при нейтральном pH 32. Во-первых, мы подтвердили, что pLK взаимодействует с доменом Ct αS с помощью ЯМР-спектроскопии раствора. (Рисунок 1b) с использованием αS, меченного 13C/15N, в присутствии возрастающего молярного соотношения αS:pLK.Взаимодействие pLK с Ct-доменом αS проявляется в возмущениях химического сдвига и уменьшении интенсивности пика в этом участке белка.Интересно, что когда мы смешивали αS с pLK при концентрации αS ок.5–25 мкМ в присутствии полиэтиленгликоля (5–15% ПЭГ-8) (типичный буфер LLPS: 10 мМ HEPES, pH 7,4, 100 мМ NaCl, 15% ПЭГ-8) мы сразу прошли через широкую область белковообразования. .капли наблюдались с помощью флуоресцентной (WF) и светлопольной (BF) микроскопии (рис. 1в).Капли размером 1–5 мкм, содержащие концентрированную αS (добавлено 1 мкМ αS, меченного AlexaFluor488, AF488-αS), их электростатические свойства можно определить по их устойчивости к 10% 1,6-гександиолу (1,6-HD) и чувствительности к увеличение концентрации NaCl (рис. 1в).Жидкоподобная природа коацерватов электростатического комплекса αS/pLK демонстрируется их способностью сливаться в течение миллисекунд (рис. 1г).С помощью турбидиметрии мы количественно оценили образование капель в этих условиях, подтвердили электростатическую природу основного взаимодействия, связанного с ее стабильностью (рис. 1д), и оценили влияние различных соотношений полимеров на процесс LLPS (рис. 1е).Хотя образование капель наблюдается в широком диапазоне соотношений полимеров, процесс очень благоприятный, когда pLK превышает αS.НУП также наблюдались при использовании химически различного вытесняющего агента декстрана-70 (70 кДа) или при использовании различных форматов образцов, включая капли на предметных стеклах, лунки микропланшета из различных материалов, Эппендорфские или кварцевые капилляры.
Схематическое изображение различных областей белка в вариантах WT-αS и ΔCt-αS, использованных в этом исследовании.Амфипатический N-концевой домен, гидрофобная амилоид-образующая область (NAC) и отрицательно заряженный С-концевой домен показаны синим, оранжевым и красным цветом соответственно.Показана карта чистого заряда на остаток (NCPR) WT-αS.б ЯМР-анализ взаимодействия αS/pLK в отсутствие макромолекулярных сгустков.По мере увеличения концентрации pLK (молярные соотношения αS:pLK 1:0,5, 1:1,5 и 1:10 показаны светло-зеленым, зеленым и темно-зеленым цветом соответственно).c Коацерватируйте αS/pLK (молярное соотношение 1:10) в концентрации 25 мкМ (1 мкМ αS, меченной AF488 или меченной Atto647N pLK для визуализации WF) в буфере LLPS (вверху) или с добавлением 500 мМ NaCl (внизу слева) или через 10 % 1,6-гександиол (1,6-HD; внизу справа).Масштабная линейка = 20 мкм.d Репрезентативные микроскопические изображения слияния капель BF αS/pLK (молярное соотношение 1:10) в концентрации 25 мкМ;стрелки указывают на слияние отдельных капель (красная и желтая стрелки) в новую каплю (оранжевая стрелка) в течение 200 мс).Масштабная линейка = 20 мкм.e Рассеяние света (при 350 нм) Агрегация αS/pLK в буфере LLPS до и после добавления 500 мМ NaCl или 10% 1,6-HD при 25 мкМ αS (N = 3 повтора образца, также указано среднее и стандартное отклонение).f Изображение BF (вверху) и анализ светорассеяния (при 350 нм, внизу) агрегации αS/pLK при 25 мкМ αS с увеличением молярного соотношения αS:pLK (N = 3 повтора образца, также указано среднее и стандартное отклонение).Масштабная линейка = 10 мкм.Масштабная полоса на одном изображении указывает масштаб всех изображений на одной панели.Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.
Основываясь на наших наблюдениях за конденсацией электростатического комплекса αS/pLK и предыдущих наблюдениях за αS как молекулой-клиентом конденсата тау/РНК посредством прямого взаимодействия с тау31, мы предположили, что αS и тау могут совместно сегрегировать с растворителем в отсутствие РНК. конденсат.через электростатические комплексы, а αS является каркасным белком в коацерватах αS/Tau (см. распределение заряда тау на рисунке 2e).Мы заметили, что когда 10 мкМ αS и 10 мкМ Tau441 (содержащие 1 мкМ AF488-αS и 1 мкМ Atto647N-Tau соответственно) смешивались вместе в буфере LLPS, они легко образовывали белковые агрегаты, содержащие оба белка, как видно с помощью микроскопии WF.(рис. 2а).Совместная локализация двух белков в каплях была подтверждена с помощью конфокальной (CF) микроскопии (дополнительный рисунок 1a).Аналогичное поведение наблюдалось, когда в качестве агента агрегации использовался декстран-70 (дополнительный рисунок 1c).Используя ПЭГ, меченный FITC, или декстран, мы обнаружили, что оба агента краудинга были равномерно распределены по образцам, не показывая ни сегрегации, ни ассоциации (дополнительный рисунок 1d).Скорее, это предполагает, что в этой системе они способствуют разделению фаз за счет эффектов макромолекулярного краудинга, поскольку ПЭГ является преимущественно стабильным агентом краудинга, как это видно в других системах НУП33,34.Эти богатые белком капли были чувствительны к NaCl (1 М), но не к 1,6-HD (10% об./об.), что подтверждает их электростатические свойства (дополнительные рис. 2a, b).Их жидкое поведение было подтверждено путем наблюдения за миллисекундными событиями слияния капель с помощью микроскопии BF (рис. 2б).
a Конфокальная (CF) микроскопия изображений коацерватов αS/Tau441 в буфере LLPS (10 мкМ каждого белка, 0,5 мкМ αS, меченного AF488, и Tau441, меченного Atto647N).b Репрезентативные изображения с дифференциальным интерференционным контрастом (DIC) событий слияния капель αS/Tau441 (10 мкМ для каждого белка).в Фазовая диаграмма, основанная на светорассеянии (при 350 нм) Tau441 LLPS (0–15 мкМ) в отсутствие (слева) или присутствии (справа) 50 мкМ αS.Более теплые цвета указывают на большее рассеяние.d Рассеяние света образцами αS/Tau441 LLPS с увеличением концентрации αS (Tau441 при 5 мкМ, N = 2–3 повторения образцов, как указано).e Схематическое изображение некоторых вариантов тау-белка и различных областей белка, использованных в этом исследовании: отрицательно заряженный N-концевой домен (красный), богатая пролином область (синий), домен, связывающий микротрубочки (MTBD, выделен оранжевым цветом) и парная спираль, образующая амилоид.области филаментов (PHF), расположенные внутри MTBD (серые).Показана карта чистого заряда на остаток (NCPR) Tau441.f Использование 1 мкМ αS, меченного AF488, и ΔNt-, меченного Atto647N, с использованием 1 мкМ αS или ΔCt-αS, меченного AF488, в присутствии ΔNt-Tau (вверху, 10 мкМ на белок) или K18 (внизу, 50 мкМ на белок). ) ) ) микрофотографии WF, конденсированного в буфере LLPS или K18.Масштабные линейки на одном изображении представляют масштаб всех изображений на одной панели (20 мкм для панелей a, b и f).Необработанные данные для панелей c и d предоставляются в виде файлов необработанных данных.
Чтобы проверить роль αS в этом процессе LLPS, мы сначала исследовали влияние αS на стабильность капель методом нефелометрии с использованием возрастающих концентраций NaCl (рис. 2в).Чем выше концентрация соли в образцах, содержащих αS, тем выше значения светорассеяния (при 350 нм), что указывает на стабилизирующую роль αS в данной системе ЛЛПС.Аналогичный эффект можно наблюдать, увеличив концентрацию αS (и, следовательно, соотношение αS:Tau441) примерно до 10%.10-кратное увеличение относительно концентрации тау (5 мкМ) (рис. 2г).Чтобы продемонстрировать, что αS является каркасным белком в коацерватах, мы решили исследовать поведение мутанта Tau с разрушенным LLPS, у которого отсутствует отрицательно заряженная N-концевая область (остатки 1–150, см. Рис. 2e), называемая ΔNt-Tau.Микроскопия WF и нефелометрия подтвердили, что сам ΔNt-Tau не подвергался LLPS (рис. 2f и дополнительный рисунок 2d), как сообщалось ранее 14. Однако, когда αS был добавлен к дисперсионным растворам этого усеченного варианта тау, процесс LLPS был полностью восстанавливается с плотностью капель, близкой к плотности капель полноразмерных растворов Тау и αS в аналогичных условиях и концентрациях белка.Этот процесс также можно наблюдать в условиях низкой скученности макромолекул (дополнительный рисунок 2c).Роль С-концевого участка αS, а не всей его длины, в процессе LLPS была продемонстрирована путем ингибирования образования капель с использованием С-концевого усеченного варианта αS, лишенного остатков 104–140 (рис. 1а) (ΔCt- αS) белок (рис. 2f и дополнительный рисунок 2d).Совместная локализация αS и ΔNt-Tau была подтверждена с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии (дополнительный рисунок 1b).
Для дальнейшего тестирования механизма LLPS между Tau441 и αS был использован дополнительный вариант Tau, а именно фрагмент ядра парной спиральной нити (PHF) в домене, связывающем микротрубочки (MTBD), который, если он содержит четыре характерных повторяющихся домена, также широко известных как фрагмент К18 (см. рис. 2д).Недавно сообщалось, что αS преимущественно связывается с тау-белком, расположенным в богатом пролином домене в последовательности, которая предшествует домену, связывающему микротрубочки.Однако область PHF также богата положительно заряженными остатками (см. рисунок 2e), особенно лизином (15% остатков), что побудило нас проверить, способствует ли эта область также конденсации комплекса αS/Tau.Мы заметили, что K18 сам по себе не мог вызвать LLPS в концентрациях до 100 мкМ в тестируемых условиях (буфер LLPS с 15% ПЭГ или 20% декстрана) (рис. 2f).Однако когда мы добавили 50 мкМ αS к 50 мкМ K18, с помощью нефелометрии (дополнительный рисунок 2d) и WF-микроскопии (рис. 2f) наблюдалось быстрое образование белковых капель, содержащих K18 и αS.Как и ожидалось, ΔCt-αS не смог восстановить поведение LLPS K18 (рис. 2f).Мы отмечаем, что агрегация αS/K18 требует несколько более высоких концентраций белка для индукции LLPS по сравнению с αS/ΔNt-Tau или αS/Tau441, при прочих равных условиях.Это согласуется с более сильным взаимодействием αS C-концевой области с богатым пролином Tau-доменом по сравнению с доменом, связывающим микротрубочки, как описано ранее 31 .
Учитывая, что ΔNt-Tau не может выполнять LLPS в отсутствие αS, мы выбрали этот вариант Tau в качестве модели для характеристики LLPS αS/Tau, учитывая его простоту в системах LLPS с полноразмерным Tau (изотип, Tau441/Tau441).со сложными (гетеротипическими, αS/Tau441) процессами агрегации.Мы сравнили степень агрегации αS (в составе белка конденсированной фазы fαS,c) в системах αS/Tau и αS/ΔNt-Tau методом центрифугирования и анализа в дисперсной фазе SDS-PAGE (см. 2д), обнаружили очень схожие значения. для всех белков в одинаковой концентрации.В частности, мы получили fαS,c 84 ± 2% и 79 ± 7% для αS/Tau и αS/ΔNt-Tau соответственно, что позволяет предположить, что гетеротипическое взаимодействие между αS и тау превосходит взаимодействие между молекулами тау.между.
Взаимодействие с различными поликатионами и влияние процесса конденсации на кинетику αS впервые изучали методом восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP).Мы протестировали коацерваты αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau и αS/pLK (100 мкМ αS с добавлением 2 мкМ αS AF488-αS и 100 мкМ Tau441 или ΔNt-Tau или 1 мМ pLK).Данные были получены в течение первых 30 минут после смешивания компонентов образца.Из репрезентативных изображений FRAP (рис. 3a, конденсация αS/Tau441) и соответствующих им кривых зависимости от времени (рис. 3b, дополнительный рисунок 3) видно, что кинетика αS очень похожа на кинетику коацерватов Tau441.и ΔNt-Tau, что происходит намного быстрее с pLK.Рассчитанные коэффициенты диффузии αS внутри коацервата в соответствии с FRAP (как описано Кангом и др. 35) составляют D = 0,013 ± 0,009 мкм2/с и D = 0,026 ± 0,008 мкм2/с для αS/Tau441 и αS/ΔNt- для система αS/.pLK, Tau и D = 0,18 ± 0,04 мкм2/с соответственно (рис. 3в).Однако коэффициент диффузии αS в дисперсной фазе на несколько порядков выше, чем во всех конденсированных фазах, что определено методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS, см. дополнительный рис. 3) в тех же условиях (LLPS-буфер), но в отсутствие поликатионов. ( D = 8 ± 4 мкм2/с).Таким образом, кинетика трансляции αS в коацерватах значительно снижена по сравнению с белками в дисперсной фазе из-за выраженных эффектов молекулярного краудинга, хотя все коацерваты сохраняют жидкоподобные свойства в течение первых получаса после их образования, в отличие от тау-фазы.более быстрая кинетика в конденсате pLK.
a – c FRAP-анализ динамики αS (2% αS, меченного AF488) в электростатических коацерватах.Репрезентативные изображения анализов αS/Tau441 FRAP в трех экземплярах показаны на (а), где красные кружки обозначают обесцвеченные области.Масштабная линейка составляет 5 мкм.б Средние кривые FRAP и (в) рассчитанные коэффициенты диффузии (D) для 5–6 (N) различных капель из трех экспериментов с использованием 100 мкМ αS и эквимолярных концентраций Tau441 (красный) или ΔNt-Tau (синий) или pLK (зеленый) в десять раз превышающую концентрацию LLPS.Стандартное отклонение кривой FRAP показано заштрихованным цветом.Для сравнения коэффициент диффузии αS в дисперсной фазе определялся в трех экземплярах с использованием флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS) (дополнительную информацию см. на дополнительном рисунке 3 и методах).d Непрерывные спектры ЭПР Х-диапазона 100 мкМ TEMPOL-122-αS в буфере LLPS без какого-либо поликатиона (черный) или в присутствии 100 мкМ Tau441 (красный) или ΔNt-Tau (синий) или 1 мМ pLK (зеленый).На вставке показано увеличенное изображение сильных силовых линий, где происходят наиболее резкие изменения.д Кривые связывания 50 мкМ TEMPOL-122-αS с различными поликатионами в отсутствие LLPS (без ПЭГ).Показано, что уменьшенная амплитуда полосы III по сравнению с полосой II (IIII/III) нормализованного спектра ЭПР увеличивает мольные соотношения Tau441 (красный), ΔNt-Tau (синий) и pLK (зеленый).Цветные линии показывают соответствие данным с использованием грубой модели связывания с n идентичными и независимыми сайтами связывания на каждой кривой.Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.
В качестве дополнения мы исследовали динамику αS в различных коацерватах, используя направленное спиновое мечение (SDSL) и непрерывный электронный парамагнитный резонанс (CW-EPR).Этот метод оказался очень полезным для составления отчетов о гибкости и динамике IDP с реалистичным остаточным разрешением36,37,38.С этой целью мы сконструировали остатки цистеина в одиночных мутантах Cys и использовали спиновый зонд 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL).Их маркируют производными малеимида.Более конкретно, мы вставили зонды TEMPOL в положение 122 или 24 αS (TEMPOL-122-αS и TEMPOL-24-αS).В первом случае мы нацелены на С-концевую область белка, которая участвует во взаимодействии с поликатионами.Вместо этого позиция 24 может дать нам информацию об общей динамике белков в конденсате.В обоих случаях сигналы ЭПР, полученные для белков дисперсной фазы, соответствовали нитроксильным радикалам в быстродвижущемся состоянии.После разделения фаз в присутствии тау или ПЛК (100 мкМ TEMPOL-αS, Tau441 или ΔNt-Tau в соотношении 1:1 или ПЛК в соотношении 1:10) наблюдалось увеличение относительной интенсивности пика в спектр ЭПР αS.Линия потерь расширилась, что указывает на снижение кинетики переориентации αS в каплях по сравнению с белком в разбавленной фазе (рис. 3d, дополнительный рис. 4a).Эти изменения более выражены в положении 122. Хотя в положении 24 присутствие pLK не влияло на кинетику зонда, в положении 122 форма спектральной линии значительно изменилась (дополнительный рисунок 4а).Когда мы попытались смоделировать спектры в положении 122 двух систем αS/поликатион, используя изотропную модель (дополнительный рисунок 5a), обычно используемую для описания динамики спин-меченого IDP38,39, мы не смогли восстановить экспериментальные спектры..Спектральное моделирование положения 24 спиновых контрастов (дополнительный рисунок 5а).Это свидетельствует о наличии преимущественных положений в пространстве спиновых конфигураций С-концевой области αS в присутствии поликатионов.При учете доли αS в конденсированной фазе в условиях экспериментального ЭПР (84 ± 2%, 79 ± 7% и 47 ± 4% для αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau и αS/pLK соответственно — см. доп. На рис. 2д анализа данных в) видно, что уширение, обнаруженное методом ЭПР, в основном отражает взаимодействие С-концевой области αS с различными поликатионами в конденсированной фазе (основное изменение при использовании TEMPOL-122- αS), а не конденсацию белка.В зонде наблюдается увеличение микровязкости.Как и ожидалось, спектр ЭПР белка в условиях, отличных от LLPS, полностью восстанавливался при добавлении к смеси 1 М NaCl (дополнительный рисунок 4b).В целом наши данные позволяют предположить, что изменения, обнаруженные с помощью CW-EPR, в основном отражают взаимодействие C-концевой области αS с различными поликатионами в конденсированной фазе, и это взаимодействие оказывается более сильным с pLK, чем с Tau.
Чтобы получить больше структурной информации о белках в коацервате, мы решили изучить систему LLPS с помощью ЯМР в растворе.Однако нам удалось обнаружить только фракцию αS, оставшуюся в дисперсной фазе, что может быть связано со снижением динамики белка внутри коацервата и плотной фазой на дне раствора при ЯМР-анализе.Когда мы проанализировали структуру и динамику белка, оставшегося в дисперсной фазе образца LLPS, с помощью ЯМР (дополнительные рис. 5c, d), мы заметили, что белок вел себя почти одинаково в присутствии pLK и ΔNt-Tau, обоих которые находились во вторичной структуре и динамике белкового остова, выявленные экспериментами по вторичному химическому сдвигу и релаксации R1ρ.Данные ЯМР показывают, что С-конец αS значительно теряет конформационную гибкость, сохраняя при этом свою неупорядоченную природу, как и остальная часть белковой последовательности, из-за его взаимодействия с поликатионами.
Поскольку уширение сигнала CW-ЭПР, наблюдаемое в конденсированной фазе TEMPOL-122-αS, отражает взаимодействие белка с поликатионами, мы провели ЭПР-титрование для оценки сродства связывания αS с различными поликатионами в отсутствие LLPS (отсутствие накопления Буфер LLPS), что позволяет предположить, что взаимодействия одинаковы в разбавленной и концентрированной фазах (что подтверждается нашими данными, дополнительным рис. 4а и дополнительным рис. 6).Цель состояла в том, чтобы увидеть, все ли коацерваты, несмотря на их общие жидкоподобные свойства, демонстрируют какое-либо основное дифференциальное поведение на молекулярном уровне.Как и ожидалось, спектр ЭПР расширялся с увеличением концентрации поликатиона, отражая снижение молекулярной гибкости из-за молекулярных взаимодействий всех партнеров по взаимодействию почти до насыщения (рис. 3e, дополнительный рисунок 6).pLK достиг такого насыщения при более низком молярном соотношении (поликатион:αS) по сравнению с ΔNt-Tau и Tau441.Фактически, сравнение данных с приблизительной моделью связывания, предполагающей n идентичных и независимых сайтов связывания, показало, что кажущаяся константа диссоциации pLK (~5 мкМ) на порядок ниже, чем у Tau441 или ΔNt-Tau (~50 мкМ). ).мкМ).Хотя это приблизительная оценка, она предполагает, что αS имеет более высокое сродство к более простым поликатионам с непрерывными областями положительного заряда.Учитывая эту разницу в сродстве между αS и различными поликатионами, мы предположили, что их жидкие свойства могут меняться по-разному с течением времени и, следовательно, страдать от разных процессов LSPT.
Учитывая очень густонаселенную среду внутри коацервата белка и амилоидную природу белка, мы наблюдали за поведением коацервата с течением времени, чтобы обнаружить возможные процессы LSPT.Используя микроскопию BF и CF (рис. 4), мы заметили, что αS/Tau441 в значительной степени коацервируется в растворе, образуя большие капли, которые контактируют и смачивают поверхность на дне лунки/предметного стекла в виде полных капель, как и ожидалось (дополнительный рис. .7г);мы называем эти структуры, образованные дном, «белковыми плотами».Эти структуры оставались жидкими, поскольку сохраняли способность сливаться (дополнительный рисунок 7b) и их можно было увидеть в течение нескольких часов после запуска LLPS (рис. 4 и дополнительный рисунок 7c).Мы заметили, что процесс смачивания предпочтителен на поверхности гидрофильных, а не гидрофобных материалов (дополнительный рисунок 7a), как и ожидалось для электростатических коацерватов с несбалансированными зарядами и, следовательно, с высокими электростатическими поверхностными потенциалами.Примечательно, что коалесценция и рафтинг αS/ΔNt-Tau значительно уменьшились, а количество конденсатов αS/pLK значительно уменьшилось (рис. 4).В течение короткого времени инкубации капли αS/pLK были способны сливаться и смачивать гидрофильную поверхность, но этот процесс быстро прекращался, и после 5 часов инкубации наблюдались лишь ограниченные случаи слияния и никакого смачивания.– гель-капельный переход.
Репрезентативные BF (панели в оттенках серого) и CF (правые панели, αS, меченный AF488 зеленым цветом) образцов коацервата, содержащих 100 мкМ αS (1% флуоресцентной метки) в буфере LLPS в присутствии 100 мкМ Tau441 (вверху) флуоресценция) микроскопические изображения ΔNt -Тау (в центре) или 1 мМ ПЛК (внизу) при разном времени инкубации и фокусной высоте (z, расстояние от нижней части лунки планшета).Эксперименты повторялись 4-6 раз независимо друг от друга с одинаковыми результатами.Коацерваты αS/Tau441 смачиваются через 24 часа, образуя плоты размером больше изображения.Масштабная линейка для всех изображений составляет 20 мкм.
Затем мы спросили, приведут ли большие пулы жидкоподобных белков, образующиеся в LLPS αS/Tau441, к амилоидной агрегации любого из изученных белков.Мы следили за созреванием капель αS/Tau441 с течением времени с помощью WF-микроскопии в тех же условиях, что и выше, но с использованием 1 мкМ αS, меченного AF488, и Tau441, меченного Atto647N (рис. 5а).Как и ожидалось, мы наблюдали полную локализацию белка на протяжении всего процесса созревания.Интересно, что начиная с ок.Через 5 часов внутри рафтов наблюдались более интенсивные некруглые структуры, которые мы назвали «точками», часть из которых была колокализована с αS, а часть обогащена Тау441 (рис. 5а, белые стрелки).Эти пятна всегда наблюдались внутри рафтов в большей степени для αS/ΔNt-Tau, чем для αS/ΔNt-Tau.В каплях систем pLK и Tau, неспособных к слиянию/смачиванию, отчетливых пятен не обнаружено.Чтобы проверить, являются ли эти пятна, содержащие αS и Tau441, амилоидоподобными агрегатами, мы провели аналогичный эксперимент с использованием CF-микроскопии, в которой Tau441 был помечен Atto647N и с самого начала было добавлено 12,5 мкМ амилоид-специфического тиофлавина-Т (ThT).краситель.Хотя ThT-окрашивание капель или рафтов αS/Tau441 не наблюдалось даже после 24 ч инкубации (рис. 5б, верхний ряд — оставшиеся капли над белковыми рафтами), ThT-положительные структуры, содержащие Atto647N-Tau441 внутри рафтов, были очень слабыми.это повторяет размер, форму и расположение ранее описанных пятен (рис. 5б, средний и нижний ряды), что позволяет предположить, что пятна могут соответствовать амилоидоподобным агрегатам, образующимся в коацерватах стареющей жидкости.
WF 25 мкМ αS при различных временах инкубации и фокусных высотах (z, расстояние от несвязанного дна) в присутствии 25 мкМ Tau441 (1 мкМ αS, меченного AF488, и Tau441, меченного Atto647N) в лунке планшета для микроскопа с буфером LLPS) .Шесть экспериментов были независимо повторены с аналогичными результатами.б CF-микроскопическое изображение 25 мкМ αS в присутствии 25 мкМ Tau441 (1 мкМ Tau441, меченного Atto647N) и 12,5 мкМ тиофлавина-Т (ThT).Взвешенные белковые капли и отложившиеся белковые плоты и пятна показаны в верхнем и среднем рядах соответственно.В нижнем ряду показаны изображения плотов и капель из 3 независимых повторов.Белые стрелки указывают ThT-положительные точки на обеих панелях.Масштабная линейка для всех изображений составляет 20 мкм.
Чтобы более подробно изучить изменения в белковой сети коацервата при переходе от жидкости к твердой форме, мы использовали флуоресцентную визуализацию времени жизни (FLIM) и микроскопию резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) (рис. 6 и дополнительные рисунки 8 и 9).Мы предположили, что коацерватное созревание слоя в более конденсированную или даже твердоподобную агрегированную белковую структуру приводит к более тесному контакту между белком и прикрепленным к нему флуоресцентным зондом, потенциально вызывая эффект тушения, проявляющийся в сокращении времени жизни зонда (τ). , как описано ранее40.,41,42.Кроме того, для дважды меченных образцов (AF488 и Atto647N в качестве донорного и акцепторного красителей FRET соответственно) такое снижение τ также может сопровождаться коацерватной конденсацией и увеличением эффективности FRET(E) во время LSPT.Мы отслеживали образование рафтов и пятен с течением времени в образцах LLPS αS/Tau441 и αS/ΔNt-Tau (25 мкМ каждого белка в буфере LLPS, содержащем 1 мкМ AF488, меченного αS, и/или Atto647N, меченного Tau441 или ΔNt-Tau).Мы наблюдали общую тенденцию: время жизни флуоресценции зондов AF488 (τ488) и Atto647N (τ647N) немного уменьшалось по мере созревания коацерватов (рис. 6 и дополнительный рисунок 8c).Интересно, что это изменение было значительно усилено для точек внутри рафтов (рис. 6c), указывая на то, что дальнейшая конденсация белка происходила в точках.В подтверждение этого не наблюдалось никаких существенных изменений во времени жизни флуоресценции для капель αS/ΔNt-Tau, выдержанных в течение 24 часов (дополнительный рисунок 8d), что позволяет предположить, что гелеобразование капель представляет собой процесс, отличный от образования пятен, и не сопровождается значительной молекулярной реорганизацией. внутри коацерватов.Следует отметить, что точки имеют разные размеры и различное содержание в αS, особенно для системы αS/Tau441 (дополнительный рисунок 8e).Уменьшение времени жизни точечной флуоресценции сопровождалось увеличением интенсивности, особенно для Atto647N, меченного Tau441 (дополнительный рисунок 8a), и более высокой эффективностью FRET как для систем αS/Tau441, так и для αS/ΔNt-Tau, что указывает на дальнейшую конденсацию в LLPS. Пять часов после срабатывания белки внутри статического электричества конденсировались.По сравнению с αS/ΔNt-Tau мы наблюдали более низкие значения τ647N и несколько более высокие значения τ488 в пятнах αS/Tau441, сопровождающиеся более низкими и более неоднородными значениями FRET.Возможно, это может быть связано с тем, что в системе αS/Tau441 наблюдаемое и ожидаемое содержание αS в агрегатах более неоднородно, часто субстехиометрично по сравнению с Tau, поскольку сам Tau441 также может подвергаться LLPS и агрегации (дополнительный рисунок 8e). .Однако степень слияния капель, образования рафтов и, что немаловажно, агрегации белков внутри жидкоподобных коацерватов максимальна при наличии как Tau441, так и αS.
a Изображения прижизненной флуоресцентной микроскопии (FLIM) αS/Tau441 и αS/ΔNt-Tau при 25 мкМ каждого белка (1 мкМ αS, меченного AF488, и 1 мкМ Tau441, меченного Atto647N, или ΔNt-Tau) в буфере LLPS.В столбцах показаны репрезентативные изображения образцов LLPS в разное время созревания (30 минут, 5 часов и 24 часа).Красной рамкой показана область, содержащая пятна αS/Tau441.Продолжительность жизни показана в виде цветных полос.Масштабная линейка = 20 мкм для всех изображений.b Увеличенное FLIM-изображение выбранной области, показанное в красной рамке на панели a.Диапазоны жизни показаны в той же цветовой шкале, что и на панели а.Масштабная линейка = 5 мкм.c Гистограммы, показывающие AF488 (присоединенный к αS) или Atto647N (присоединенный к Tau) для различных видов белков (капли-D-, рафт-R- и спекл-P), идентифицированных на изображениях FLIM, записанных для αS-), временные распределения времени жизни Tau441 и Образцы коацервата αS/ΔNt-Tau (N = 17–32 ROI для D, 29–44 ROI для R и 21–51 ROI для точек).Средние и медианные значения показаны желтыми квадратами и черными линиями внутри прямоугольников соответственно.Нижняя и верхняя границы прямоугольника представляют собой первый и третий квартиль соответственно, а минимальные и максимальные значения в пределах 1,5-кратного межквартильного диапазона (IQR) показаны в виде «усов».Выбросы показаны черными ромбами.Статистическая значимость между парами распределений определялась с использованием двухвыборочного t-критерия, предполагающего неравные дисперсии.P-значения двустороннего t-теста показаны звездочками для каждой пары сравниваемых данных (* p-значение > 0,01, ** p-значение > 0,001, *** p-значение > 0,0001, **** Значение p > 0,00001), нс Указывает на пренебрежение (значение p > 0,05).Точные значения p приведены в дополнительной таблице 1, а исходные данные представлены в виде файлов необработанных данных.
Чтобы дополнительно продемонстрировать амилоидную природу спеклов/агрегатов, мы обрабатывали неокрашенные образцы коацервата в течение 24 часов высокими концентрациями (1 М) NaCl, что приводило к отделению агрегатов от белковых коацерватов.Когда изолированные агрегаты (т.е. дисперсный раствор агрегатов) наблюдали с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), мы наблюдали преимущественно сферическую морфологию с регулярной высотой около 15 нм, которая имеет тенденцию к ассоциации в условиях высокой концентрации соли, подобной поведение типичных амилоидных фибрилл из-за сильного гидрофобного эффекта на поверхности (обратите внимание, что фибриллы обычно имеют высоту ~ 10 нм) (дополнительный рисунок 10а).Интересно, что когда изолированные агрегаты инкубировали с ThT в стандартном флуоресцентном анализе ThT, мы наблюдали резкое увеличение квантового выхода флуоресценции ThT, сравнимое с тем, которое наблюдалось, когда краситель инкубировали с типичными αS-амилоидными фибриллами (дополнительный рисунок 10b), предполагая, что коацерватные агрегаты содержат амилоидные структуры..Фактически, агрегаты были толерантны к высоким концентрациям соли, но чувствительны к 4 М гуанидинхлориду (GdnHCl), как и типичные амилоидные фибриллы (дополнительный рисунок 10c).
Затем мы проанализировали состав агрегатов с использованием флуоресценции одиночных молекул, специфической корреляционной/кросс-корреляционной спектроскопии флуоресценции (FCS/FCCS) и пакетного анализа обнаружения двухцветных совпадений (TCCD).С этой целью мы выделили агрегаты, образовавшиеся после 24 часов инкубации в образцах LLPS объемом 100 мкл, содержащих αS и Tau441 (оба по 25 мкМ) вместе с 1 мкМ αS, меченным AF488, и 1 мкМ Tau441, меченным Atto647N.Разбавьте полученный раствор диспергированного агрегата до мономолекулярного состояния, используя тот же буфер, не содержащий ПЭГ, и 1 М NaCl (тот же буфер, который используется для отделения агрегатов от коацервата), чтобы предотвратить любые возможные электростатические взаимодействия между LLPS и белком.Пример временной траектории одиночной молекулы можно увидеть на рис. 7а.Анализ FCCS/FCS (кросс-корреляция, CC и автокорреляция, AC) показал, что в образцах было много агрегатов, содержащих αS и тау (см. кривую CC на рис. 7б, левая панель), а избыток остаточного мономерного белка возникал как результат процесса разбавления (см. кривые переменного тока на рисунке 7b, левая панель).Контрольные эксперименты, проведенные в тех же условиях раствора с использованием образцов, содержащих только мономерные белки, не показали кривых CC, а кривые AC хорошо согласуются с моделью однокомпонентной диффузии (уравнение 4), где мономерные белки имеют ожидаемые коэффициенты диффузии (рис. 7б). ), правая панель).Коэффициент диффузии агрегированных частиц составляет менее 1 мкм2/с, мономерных белков — около 1 мкм2/с.50–100 мкм/с;значения аналогичны ранее опубликованным значениям для обработанных ультразвуком амилоидных фибрилл αS и мономерного αS отдельно в аналогичных условиях раствора44.Когда мы анализировали агрегаты методом взрыва TCCD (рис. 7в, верхняя панель), мы обнаружили, что в каждом изолированном агрегате (гетероагрегат αS/Tau) около 60% обнаруженных агрегатов содержали как αS, так и тау, около 30% содержали только тау, только около 10% αS.Стехиометрический анализ гетероагрегатов αS/Tau показал, что большая часть гетероагрегатов обогащена тау (стехиометрия ниже 0,5, среднее количество молекул тау на агрегат в 4 раза больше, чем молекул αS), что согласуется с нашими работами, наблюдаемыми в FLIM in situ. эксперименты..FRET-анализ показал, что эти агрегаты содержат оба белка, хотя реальные значения FRET в данном случае не имеют большого значения, поскольку распределение флуорофоров в каждом агрегате было случайным из-за избытка использованного в эксперименте немеченого белка.Интересно, что когда мы провели тот же анализ с использованием варианта Tau 45,46 со зрелым амилоидом с дефицитом агрегации (см. дополнительные рис. 11a,b), мы заметили, что, хотя электростатическая агрегация αS была такой же (дополнительные рис. 11c, d), способность образовывать агрегаты внутри коацервата была резко снижена, и FLIM обнаружил несколько пятен в экспериментах in situ, а для изолированных образцов агрегатов наблюдались слабые кривые взаимной корреляции.Однако для небольшого количества обнаруженных агрегатов (всего одна десятая часть Tau441) мы наблюдали, что каждый агрегат был обогащен αS, чем этот вариант Tau, причем примерно 50% обнаруженных агрегатов содержали только молекулы αS, а αS был гетерогенен в избытке. .агрегаты (см. дополнительный рисунок 11e), в отличие от гетерогенных агрегатов, генерируемых Tau441 (рис. 6f).Результаты этих экспериментов показали, что, хотя сам αS способен накапливаться вместе с тау внутри коацервата, зарождение тау в этих условиях более благоприятно, и образующиеся амилоидоподобные агрегаты способны действовать как форма αS и тау.Однако после формирования богатого тау ядра гетеротипические взаимодействия между αS и тау в агрегатах предпочтительнее гомотипических взаимодействий между молекулами тау;мы также наблюдаем белковые сети в жидких коацерватах αS/tau.
Репрезентативные временные следы флуоресценции одиночных молекул изолированных агрегатов, образовавшихся в электростатических коацерватах αS/Tau441.Всплески, соответствующие коагрегатам αS/Tau441 (всплески выше указанного порога), наблюдались в трех каналах регистрации (эмиссия AF488 и Atto647N после прямого возбуждения, синие и красные линии, эмиссия Atto647N после непрямого возбуждения), FRET, фиолетовая линия).б FCS/FCCS-анализ образца изолированных агрегатов αS/Tau441, полученных из LLPS (левая панель).Кривые автокорреляции (AC) для AF488 и Atto647N показаны синим и красным цветом соответственно, а кривые взаимной корреляции (CC), связанные с агрегатами, содержащими оба красителя, показаны фиолетовым цветом.Кривые AC отражают наличие меченых мономерных и агрегированных видов белка, тогда как кривые CC показывают только диффузию агрегатов с двойной меткой.Тот же анализ, но в тех же условиях растворения, что и в изолированных пятнах, образцы, содержащие только мономерные αS и Tau441, показаны в качестве контроля на правой панели.в Флуоресцентный флэш-анализ одиночных молекул изолированных агрегатов, образовавшихся в электростатических коацерватах αS/Tau441.Информация для каждого агрегата, обнаруженного в четырех различных повторах (N = 152), отображается в зависимости от их стехиометрии, значений S и эффективности FRET (верхняя панель, цветная полоса отражает возникновение).Можно выделить три типа агрегатов: -αS-агрегаты с S~1 и FRET~0, только Tau-агрегаты с S~0 и FRET~1 и гетерогенные агрегаты Tau/αS с промежуточными S и FRET. Оценки количества обоих маркерных белков, обнаруженных в каждом гетерогенном агрегате (N = 100), показано на нижней панели (цветовая шкала отражает встречаемость).Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.
Сообщалось, что созревание или старение жидких белковых конденсатов в гелеобразные или твердые структуры с течением времени участвует в нескольких физиологических функциях конденсата47, а также в заболеваниях, как аномальный процесс, предшествующий агрегации амилоида 7, 48, 49. Здесь мы подробно изучаем фазовое разделение и поведение.LSPT αS в присутствии случайных поликатионов в контролируемой среде при низких микромолярных концентрациях и физиологически значимых условиях (обратите внимание, что расчетная физиологическая концентрация αS составляет >1 мкМ50), что соответствует типичному термодинамически обусловленному поведению ЛПС.Мы обнаружили, что αS, которая содержит сильно отрицательно заряженную С-концевую область при физиологическом pH, способна образовывать богатые белком капли в водном растворе посредством LLPS в присутствии сильно катионных неупорядоченных пептидов, таких как pLK или Tau, посредством процесса электростатического воздействия. сложная конденсация в присутствии агрегированных макромолекул.Этот процесс может иметь соответствующие эффекты в клеточной среде, где αS сталкивается с различными поликатионными молекулами, связанными с его агрегацией, связанной с заболеванием, как in vitro, так и in vivo51,52,53,54.
Во многих исследованиях динамика белков внутри капель рассматривалась как один из ключевых факторов, определяющих процесс созревания55,56.В электростатических коацерватах αS с поликатионами процесс созревания, по-видимому, зависит от силы взаимодействия с поликатионами, валентности и кратности этих взаимодействий.Теория равновесия предполагает, что равновесная среда двух жидких состояний будет заключаться в наличии большой капли, богатой биополимерами, которые управляют LLPS57,58.Рост капель может быть достигнут за счет созревания Оствальда59, коалесценции60 или потребления свободного мономера в дисперсной фазе61.Для αS и Tau441, ΔNt-Tau или pLK большая часть белка концентрировалась в конденсате в условиях, использованных в данном исследовании.Однако, хотя полноразмерные капли тау быстро объединялись при смачивании поверхности, слияние и смачивание капель были затруднены для ΔNt-Tau и pLK, что указывает на быструю потерю свойств жидкости в этих двух системах.Согласно нашему анализу FLIM-FRET, состаренные капли pLK и ΔNt-Tau показали такую ​​же степень агрегации белка (сходное время жизни флуоресценции), что и исходные капли, что позволяет предположить, что исходная белковая сеть сохранилась, хотя и более жесткая.
Мы рационализируем наши экспериментальные результаты в следующей модели (рис. 8).Первоначально временно сформированные капли часто представляют собой белковые сети без электростатической компенсации, и поэтому существуют области дисбаланса зарядов, особенно на границе раздела капель, что приводит к образованию капель с высоким электростатическим поверхностным потенциалом.Чтобы компенсировать заряд (явление, обычно называемое истощением валентности) и минимизировать поверхностный потенциал капель, капли могут включать новые полипептиды из разбавленной фазы, реорганизовывать белковые сети для оптимизации взаимодействий заряд-заряд и взаимодействовать с другими каплями.с поверхностями (смачивание).Капли αS/pLK из-за их более простой белковой сети (только гетеротипические взаимодействия между αS и pLK) и большего сродства к белок-белковым взаимодействиям, по-видимому, способны быстрее уравновешивать заряд конденсата;действительно, мы наблюдали более быструю кинетику белка в первоначально образовавшихся коацерватах αS/pLK, чем в αS/Tau.После истощения валентности взаимодействия становятся менее эфемерными, капли теряют свои жидкие свойства и превращаются в гелеобразные, негорючие капли с низким электростатическим поверхностным потенциалом (и, следовательно, неспособные смачивать поверхность).Напротив, капли αS/Tau менее эффективны в оптимизации баланса заряда капель из-за более сложных белковых сетей (как с гомотипическими, так и с гетеротипическими взаимодействиями) и более слабой природы белковых взаимодействий.Это приводит к тому, что капли сохраняют жидкое поведение в течение продолжительных периодов времени и демонстрируют высокий электростатический поверхностный потенциал, который имеет тенденцию минимизироваться за счет слияния и роста (таким образом сводя к минимуму соотношение площади поверхности к объему капель) и за счет смачивания гидрофильной поверхности.Это создает большие концентрированные библиотеки белков, которые сохраняют свойства жидкости, поскольку взаимодействия остаются очень временными из-за постоянного поиска оптимизации заряда в белковой сети.Интересно, что усеченные на N-конце формы тау, включая некоторые встречающиеся в природе изоформы62, демонстрируют промежуточное поведение: некоторые коацерваты стареют под действием αS в долгоживущие гелеобразные капли, тогда как другие трансформируются в большие жидкие конденсаты.Эта двойственность в созревании электростатических коацерватов αS согласуется с недавними теоретическими и экспериментальными исследованиями LLPS, которые выявили корреляцию между истощением валентности и электростатическим просеиванием в конденсатах как ключ к контролю размера конденсата и свойств жидкости.Механизм 58.61.
На этой схеме показан предполагаемый путь агрегации амилоида для αS и Tau441 через LLPS и LSPT.Благодаря дополнительным областям, богатым анионами (красный) и катионами (синий), электростатические коацерваты αS и тау с удовлетворительной валентностью имеют более низкую поверхностную энергию и, следовательно, меньшую коалесценцию, что приводит к быстрому старению капель.Достигается стабильное неагломерированное состояние геля..Эта ситуация очень благоприятна в случае системы αS/pLK из-за ее более высокого сродства и более простой сети взаимодействия пар белков, что обеспечивает быстрый гелеобразный переход.Напротив, капли с неудовлетворительной валентностью и, следовательно, заряженные белком области, доступные для взаимодействия, облегчают коацервату слияние и смачивание гидрофильной поверхности с целью снижения его высокой поверхностной энергии.Эта ситуация предпочтительна для коацерватов αS/Tau441, которые имеют многовалентную сложную сеть, состоящую из слабых взаимодействий Тау-Тау и αS-Тау.В свою очередь, более крупные коацерваты легче сохраняют свои жидкоподобные свойства, позволяя происходить другим межбелковым взаимодействиям.В конце концов, в коацерватной жидкости формируются гетерогенные амилоидные агрегаты, содержащие как αS, так и тау, которые могут быть связаны с агрегатами, обнаруживаемыми в тельцах включения, которые являются признаками нейродегенеративных заболеваний.
Большие жидкоподобные структуры, образующиеся во время созревания αS/Tau441 с сильно перегруженной, но динамичной белковой средой и, в меньшей степени, коацерватами αS/ΔNt-Tau, являются идеальными резервуарами для зарождения агрегации белков.Мы действительно наблюдали образование твердых белковых агрегатов в этом типе белковых коацерватов, часто содержащих как αS, так и тау.Мы показали, что эти гетероагрегаты стабилизируются за счет неэлектростатических взаимодействий, способны связывать амилоид-специфичные красители ThT так же, как типичные амилоидные фибриллы, и действительно обладают сходной устойчивостью к различным воздействиям.Показано, что агрегаты αS/tau, образуемые LLPS, обладают амилоидными свойствами.Действительно, зрелый вариант тау, дефицитный по агрегации амилоида, значительно нарушен в формировании этих гетерогенных агрегатов αS внутри жидкого электростатического коацервата.Образование агрегатов αS/Tau441 наблюдалось только внутри коацерватов, сохраняющих жидкоподобные свойства, и никогда, если коацерваты/капли не достигли состояния геля.В последнем случае повышенная сила электростатических взаимодействий и, как следствие, жесткость белковой сети препятствуют необходимым конформационным перестройкам белков для установления новых белковых взаимодействий, необходимых для зарождения амилоида.Однако этого можно достичь с помощью более гибких, похожих на жидкость коацерватов, которые, в свою очередь, с большей вероятностью останутся жидкими по мере увеличения размера.
Тот факт, что образование агрегатов внутри конденсированной фазы предпочтительнее в крупных конденсатах αS/Tau, чем в небольших каплях, которые быстро гелеобразуют, подчеркивает актуальность выявления факторов, контролирующих слияние капель.Таким образом, существует не только тенденция к разделению фаз, но и размер конденсата необходимо контролировать для правильного функционирования, а также для предотвращения заболеваний58,61.Наши результаты также подчеркивают важность баланса между LLPS и LSPT для системы αS/Tau.Хотя образование капель может защищать от агрегации амилоида за счет уменьшения количества белковых мономеров, доступных в условиях насыщения, как было предложено в других системах63,64, слияние капель при высоких уровнях капель может привести к внутренней агрегации белка посредством медленных конформационных перестроек.белковые сети..
В целом, наши данные убедительно подчеркивают значимость сплоченной валентности и взаимодействий удовлетворенности/неудовлетворенности в дроп-сетях в контексте LSPT.В частности, мы показываем, что полноразмерные конденсаты αS/Tau441 способны эффективно сливаться и образовывать амилоидные гетероагрегаты, которые включают оба белка, и предлагаем молекулярный механизм, основанный на наших экспериментальных результатах.Совместная агрегация двух белков в коацервате жидкости αS/Tau, о которой мы здесь сообщаем, действительно может быть связана с совместной локализацией двух белков во включениях, которые являются отличительными чертами заболевания, и может способствовать пониманию взаимосвязи между LLPS и агрегация амилоида, открывающая путь для высокозаряженного IDP при нейродегенерации.
Мономерные WT-αS, цистеиновые мутанты (Q24C-αS, N122C-αS) и варианты ΔCt-αS (Δ101-140) экспрессировали в E. coli и очищали, как описано ранее.5 мМ ДТТ включали на все стадии очистки мутантов αS-цистеина для предотвращения образования дисульфидных связей.Изоформа Tau441 (плазмида, полученная из Addgene #16316), вариант ΔNt-Tau (Δ1–150, полученный путем клонирования IVA с праймерами CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) и вариант AggDef-Tau (Δ275–311, очищенный праймером GGCTC5) культуры E. coli были выращивали до OD600 = 0,6–0,7 при 37°C и 180 об/мин и экспрессию индуцировали IPTG в течение 3 часов при 37°C.Урожай клеток при 11500 мкг в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия и промыть физиологическим буфером, содержащим 150 мМ NaCl.Ресуспендируйте осадок в буфере для лизиса (20 мл на 1 л LB: MES 20 мм, pH 6,8, NaCl 500 мм, ЭДТА 1 мм, MgCl2 0,2 ​​мм, DTT 5 мм, PMSF 1 мм, бензамидин 50 мкМ, копептин 100 мкМ).Этап обработки ультразвуком проводился на льду с амплитудой 80% в течение 10 импульсов (1 минута включена, 1 минута выключена).Не превышайте 60 мл за одно УЗИ.Лизаты E.coli нагревали при 95°С в течение 20 минут, затем охлаждали на льду и центрифугировали при 127000×g в течение 40 минут.Осветленный супернатант наносили на мембрану 3,5 кДа (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Великобритания) и диализовали против 4 л диализного буфера (20 мМ MES, pH 6,8, NaCl 50 мМ, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 2 мМ DTT). , ПМСФ 0,1 мМ) в течение 10 часов.Катионообменную колонку объемом 5 мл (HiTrap SPFF, Cytiva, Массачусетс, США) уравновешивали уравновешивающим буфером (20 мМ MES, pH 6,8, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF).Таулизат фильтровали через ПВДФ-фильтр с размером пор 0,22 мкм и вводили в колонку со скоростью потока 1 мл/мин.Элюцию проводили постепенно, тау элюировали 15–30% элюирующим буфером (20 мМ MES, pH 6,8, 1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 2 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ).Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, и любые фракции, содержащие одну полосу с ожидаемой молекулярной массой тау, концентрировали с использованием центрифужного фильтра 10 кДа и заменяли буфером, содержащим 10 мМ HEPES, pH 7,4, 500 мМ NaCl и 2 мМ DTT для конечная концентрация белка составляла 100 мкМ.Затем белковый раствор пропускали через ПВДФ-фильтр с размером пор 0,22 мкм, быстро замораживали и хранили при -80°С.Белок K18 был любезно предоставлен профессором Альберто Боффи.Чистота препарата составила >95%, что было подтверждено данными SDS-PAGE и MALDI-TOF/TOF.Различные цистеины были химически помечены AlexaFluor488-малеимидом (AF488, ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) или TEMPOL-малеимидом (Toronto Research Chemicals, Торонто, Канада).были подтверждены методами поглощения и MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau и K18 метили нативными остатками цистеина в положениях 191 и 322 с использованием Atto647N-малеимида (ATTO-TEC GmbH, Зиген, Германия) по той же процедуре.Карты чистого заряда на остаток для αS и Tau441 были созданы с использованием CIDER66.
Твердый поли-L-лизин (pLK DP 90-110 по данным ЯМР от поставщика, Alamanda Polymers Inc, Хантсвилл, Алабама, США) растворяли в 10 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, pH от 7,4 до концентрации 10 мМ, обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут на ультразвуковой водяной бане и хранить при температуре -20°C.ПЭГ-8, декстран-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Уотертаун, Массачусетс, США) и FITC-декстран-500 (Sigma-Aldrich, Сан-Луис, Мичиган, США) растворимы в воде и широко распространены в буфере LLPS.Диализ удаляет загрязняющие соли.Затем их фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и рассчитывали их концентрации с помощью рефрактометра (Mettler Toledo, Колумбус, Огайо, США).Образцы LLPS готовили при комнатной температуре в следующем порядке: смешивали буфер и экструзию и 1 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP, Carbosynth, Комптон, Великобритания), 1 мМ 2,2,2,2-(Этан- 1,2-диилдинитрил)тетрауксусная кислота (ЭДТА, карбоксинт) и смесь 1% ингибитора протеаз (ПМСФ 100 мМ, бензимид 1 мМ, лейпептин 5 мкМ).Затем добавляют αS и конденсированные поликатионы (варианты pLK или Tau).Для экспериментов с временными рядами тиофлавина-Т (ThT, Carbosynth, Комптон, Великобритания) используйте общую концентрацию ThT, равную половине концентрации αS.Аккуратно, но тщательно перемешайте образцы, чтобы они были однородными.Концентрация каждого компонента варьировалась от эксперимента к эксперименту, как описано в разделе «Результаты».Азид использовали в концентрации 0,02% (мас./об.) всякий раз, когда продолжительность эксперимента превышала 4 часа.Для всех анализов с использованием образцов LLPS перед анализом дайте смеси уравновеситься в течение 5 минут.Для анализа светорассеяния 150 мкл образцов загружали в несвязывающие 96-луночные микропланшеты (µClear®, черный, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Кремсмюнстер, Австрия) и покрывали клейкой пленкой.LLP контролировали путем измерения оптической плотности при 350 нм в центре раствора в планшет-ридере CLARIOstar (BMG Labtech, Ортенберг, Германия).Эксперименты проводили в трех повторах при 25°C, ошибки рассчитывали как стандартное отклонение от среднего значения.Разбавленную фазу количественно определяли центрифугированием образца и анализом в геле SDS-PAGE, а фракцию αS в разбавленной и концентрированной фазах определяли количественно в различных растворах LLPS.Образец LLPS объемом 100 мкл, содержащий 1 мкМ αS, меченного AF488, готовили путем тщательного перемешивания с последующим центрифугированием при 9600×g в течение 30 минут, после чего осадок обычно был виден.Верхние 50 мкл супернатанта использовали для количественного определения белка с использованием геля SDS-PAGE.Гели сканировали с помощью фильтров AF488 с использованием системы визуализации гелей ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США) или окрашивали красителем Кумасси и визуализировали с помощью соответствующих фильтров.Полученные полосы анализировали с помощью программы ImageJ версии 1.53i (Национальные институты здравоохранения, США).Эксперименты проводились дважды в двух разных экспериментах с одинаковыми результатами.
Обычно 150 мкл образцов наносили на несвязывающие 96-луночные микропланшеты и визуализировали при комнатной температуре на инвертированном микроскопе Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Вецлар, Германия).Для точечных экспериментов также использовали планшеты для ангиогенеза µ-Slide (Ibidi GmbH, Грефельфинг, Германия) или 96-луночные полистироловые микропланшеты (Corning Costar Corp., Актон, Массачусетс).В качестве источников освещения использовались галогенные или ртутные металлогалогенные лампы EL6000 (для визуализации BF/DIC и WF соответственно).Для микроскопии WF использовали воздушный объектив с 40-кратным увеличением (Leica Microsystems, Германия) для фокусировки света на образце и его сбора.Для образцов с маркировкой AF488 и ThT фильтруйте возбуждение и излучение с помощью стандартных наборов фильтров GFP, полосовых фильтров возбуждения и излучения соответственно, полосовых фильтров 460–500 нм и 512–542 нм и дихроичного зеркала 495 нм.Для образцов, меченных Atto647N, использовался стандартный набор Cy5-фильтров с полосовыми фильтрами возбуждения и излучения 628–40 нм и 692–40 нм соответственно, а также дихроичное зеркало 660 нм.Для микроскопии BF и DIC используйте один и тот же объектив для сбора отраженного света.Собранный свет записывался на ПЗС-камеру Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Германия).Время экспозиции составляло 50 мс для изображений BF и DIC-микроскопии и 20-100 мс для изображений микроскопии WF.Для сравнения, время экспозиции для всех экспериментов с ThT составляло 100 мс.Для визуализации слияния капель были проведены покадровые эксперименты, при этом изображения собирались каждые 100 мс в течение нескольких минут.ImageJ (NIH, США) использовали для анализа изображений.Эксперименты проводились в трех повторностях с одинаковыми результатами.
Для экспериментов по колокализации, FRAP и 3D-реконструкции изображения получали на инвертированном конфокальном микроскопе Zeiss LSM 880 с использованием синей версии ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Оберкохен, Германия).Образцы по 50 мкл наносили на чашки Петри µ-Slide Angiogenic (Ibidi GmbH, Грёфельфинг, Германия), обрабатывали гидрофильным полимером (ibiTreat) и устанавливали в масляно-иммерсионный объектив 63× (Plan-Apochrom 63×/NA 1.4 Oil). на ДВС).Изображения были получены с использованием линий аргонового лазера 458, 488 и 633 нм с разрешением 0,26 мкм/пиксель и временем экспозиции 8 мкс/пиксель для окон регистрации возбуждения и излучения 470–600 нм, 493–628 нм, и 638–755 нм использовали для визуализации ThT, AF488 и Atto647N соответственно.Для экспериментов FRAP записывалась покадровая фотография каждого образца со скоростью 1 кадр в секунду.Эксперименты проводились в трех повторах при комнатной температуре с аналогичными результатами.Все изображения были проанализированы с использованием программного обеспечения Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Оберкохен, Германия).Кривые FRAP были нормализованы, построены и сопоставлены с данными интенсивности/времени, извлеченными из изображений с использованием Zen 2 с использованием OriginPro 9.1.Кривые восстановления были адаптированы к моноэкспоненциальной модели для учета молекулярной диффузии с дополнительным экспоненциальным членом для учета эффекта обесцвечивания при приобретении.Затем мы рассчитали D, используя номинальный радиус отбеливания и ранее определенный период полувыведения, как в уравнении Kang et al.5 35 показано.
Одноцистеиновые варианты αS были синтезированы с 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксилом (TEMPOL) в положениях 24 (TEMPOL-24-αS) и 122 (TEMPOL-122-αS), соответственно.Спиновая метка. Для экспериментов по ЭПР концентрация αS была установлена ​​на уровне 100 мкМ, а концентрация ПЭГ составляла 15% (мас./об.).Для различных условий агрегации соотношение αS:pLK составляло 1:10, тогда как соотношения αS:ΔNt-Tau и αS:Tau441 сохранялись на уровне 1:1.Для экспериментов по титрованию связывания в отсутствие скученности TEMPOL-122-αS поддерживали при 50 мкМ, а поликатионы титровали при возрастающих концентрациях, готовя каждое условие отдельно.Измерения CW-ЭПР проводились с использованием спектрометра X-диапазона Bruker ELEXSYS E580, оснащенного резонатором Bruker ER4118 SPT-N1, работающим на микроволновой (СВЧ) частоте ~9,7 ГГц.Температуру устанавливали на уровне 25°С и контролировали с помощью криостата с жидким азотом.Спектры получены в ненасыщенных условиях при мощности СВЧ 4 мВт, амплитуде модуляции 0,1 мТл и частоте модуляции 100 кГц.Спектральные интенсивности были нормализованы, чтобы избежать различий в концентрации спинов между образцами и возможного снижения спинов из-за остаточных концентраций восстановителей в образцах, содержащих Tau441 или ΔNt-Tau (присутствующих в исходных растворах белков).Приведенные значения g были получены в результате спектрального моделирования ЭПР, выполненного с использованием программного обеспечения Easyspin (v.6.0.0-dev.34), реализованного в Matlab®67.Для моделирования данных использовались одно-/двухкомпонентные изотропные модели.После нормализации всех сигналов остатки рассчитывались путем вычитания каждого моделирования из соответствующего экспериментального спектра.Для анализа титрования связывания использовали относительную интенсивность третьей полосы по отношению ко второй полосе нормализованного спектра ЭПР (IIII/III) для мониторинга связывания поликатионов с αS.Для оценки константы диссоциации (Kd) полученную кривую аппроксимировали приближенной моделью, предполагая n идентичных и независимых сайтов связывания.
Эксперименты по ЯМР-спектроскопии проводили с использованием ЯМР-спектрометра Bruker Neo 800 МГц (1H), оснащенного криозондом и Z-градиентом.Все эксперименты проводились с использованием 130–207 мкМ αS и соответствующих эквивалентов αS/ΔNt-Tau и pLK в 10 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 10% DO, pH 7,4 и проводились при 15°C.Для мониторинга ЛПС с помощью ЯМР к предварительно смешанным образцам добавляли 10% ПЭГ.График возмущений химического сдвига (рис. 1б) показывает средние химические сдвиги 1H и 15N.Спектры αS 2D1H-15N HSQC были присвоены на основе предыдущего присвоения (запись BMRB № 25227) и подтверждены записью и анализом 3D-спектров HNCA, HNCO и CBCAcoNH.Химические сдвиги 13Cα и 13Cβ были рассчитаны в присутствии ΔNt-Tau или pLK для измерения возможных изменений тенденций вторичной структуры по сравнению с химическими сдвигами αS в чисто случайной конформации клубка 68 (дополнительная фигура 5c).Скорости R1ρ измерялись путем записи экспериментов hsqctretf3gpsi (полученных из библиотеки Bruker) с задержками 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 и 800 мс, а экспоненциальные функции были скорректированы с учетом задержек пиковой интенсивности при различных раз, чтобы определить R1ρ и его экспериментальную неопределенность.
Эксперименты по двухцветной флуоресцентной микроскопии с временным разрешением проводились на коммерческом флуоресцентном конфокальном микроскопе MT200 с временным разрешением (PicoQuant, Берлин, Германия) с устройством подсчета одиночных фотонов с временной корреляцией (TCSPC).Головка лазерного диода используется для импульсного чередующегося возбуждения (PIE), луч проходит через одномодовый волновод и настраивается на мощность лазера от 10 до 100 нВт для лазерных линий 481 нм и 637 нм, измеренных после дихроичного зеркала.Это обеспечивает оптимальную скорость счета фотонов, избегая эффектов совмещения фотонов, фотообесцвечивания и насыщения.Покровные стекла или планшеты для ангиогенеза μ-Slide (Ibidi GmbH, Грефельфинг, Германия) помещали непосредственно в иммерсионную воду над линзой Super Apochromate 60x NA 1.2 с корректирующим воротником (Olympus Life Sciences, Уолтем, США).В качестве светоделителя основного луча использовалось дихроичное зеркало 488/640 нм (Semrock, Лейк Форест, Иллинойс, США).Несфокусированное излучение блокируется отверстием диаметром 50 микрон, затем сфокусированное излучение разделяется на 2 пути обнаружения светоделителем 50/50.Перед детектором использовались полосовые эмиссионные фильтры (Semrock, Лейк-Форест, Иллинойс, США) 520/35 для зеленого красителя (AF488) и 690/70 для красного красителя (Atto647N).В качестве детекторов использовались однофотонные лавинные диоды (SPAD) (Micro Photon Devices, Больцано, Италия).Сбор и анализ данных проводили с использованием коммерчески доступного программного обеспечения SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Берлин, Германия).
Пятьдесят микролитров образцов LLPS наносили на лунки ангиогенеза μ-Slide (Ibidi GmbH, Грефельфинг, Германия).Полученные изображения фокусируются на высоте до 20 мкм над дном лунки для оптимального рабочего расстояния объектива для взвешенных капель и до ~1 мкм для плотов и точек с осевым разрешением не менее 0,25 мкм/пиксель и временем задержки 400 мкс/пиксель.Выберите данные, применив порог интенсивности на основе средней интенсивности фонового сигнала (PBG, среднее + 2σ) для каждого канала так, чтобы выбирались только капли, плоты или пятна жидкого белка, отфильтровывая любое возможное происхождение из дисперсной фазы.Чтобы проанализировать продолжительность жизни каждого вида (τ) каждого канала (зеленый, «g» для AF488 и красный, «r» для Atto647N), мы выбрали области интереса (ROI), содержащие капли, плоты или пятна (дополнительный рисунок 1). ).8b) и получили их путем подбора их распада за время жизни (τD, τR и τP для капель, плотов или пятен соответственно, см. дополнительный рисунок 8c) в каждом канале с использованием анализа хвостовой подгонки и двухкомпонентной модели распада.Среднее τ от τ .ROI, которые производили слишком мало фотонов для многоэкспоненциальной аппроксимации, были исключены из анализа.Используемое пороговое значение составляло <104 фотонов для плотов и точек и 103 для капель.Капли имеют более низкий порог, поскольку трудно получить кривые затухания с более высокими значениями интенсивности, поскольку капли в поле изображения обычно меньше и их меньше.ROI с количеством фотонов, превышающим предел накопления фотонов (установленный на уровне > 500 отсчетов/пиксель), также были исключены из анализа.Сопоставьте кривую затухания интенсивности, полученную в интересующей области, с интенсивностью на уровне 90 % от максимума (немного после максимальной интенсивности затухания) с начала срока службы, чтобы обеспечить минимальные помехи IRF, сохраняя при этом одинаковые значения для всех затухающих интенсивностей. настройки Относительное временное окно Анализировались 25–50 ROI для рафтов и пятен и 15–25 ROI для капель, изображения были выбраны из более чем 4 повторов, записанных как минимум из 3 независимых экспериментов.Двусторонние t-критерии использовались для оценки статистических различий между видами или между коацерватными системами.Для попиксельного анализа времени жизни (τ) рассчитывалось общее затухание времени жизни по полю для каждого канала и проводилась аппроксимация 2/3-компонентной экспоненциальной модели затухания.Затем затухание за время жизни для каждого пикселя было аппроксимировано с использованием ранее рассчитанных значений τ, в результате чего было получено псевдоцветное изображение, соответствующее FLIM.Диапазон времени жизни хвостового соответствия был одинаковым для всех изображений одного и того же канала, и каждый распад производил достаточно фотонов, чтобы обеспечить надежное соответствие.Для анализа FRET пиксели отбирались путем применения нижнего порога интенсивности в 100 фотонов, что в среднем составляло фоновый сигнал (FBG) в 11 фотонов.Интенсивность флуоресценции каждого канала корректировали экспериментально определенными поправочными коэффициентами: спектральные перекрестные помехи 69 α составляли 0,004, прямое возбуждение β составляло 0,0305, эффективность регистрации γ составляла 0,517.Затем эффективность FRET на уровне пикселей рассчитывается по следующему уравнению:
где FDD — интенсивность флуоресценции, наблюдаемая в донорном (зеленом) канале, FDA — интенсивность флуоресценции, наблюдаемая в акцепторном (красном) канале при непрямом возбуждении, а FAA — интенсивность флуоресценции, наблюдаемая в акцепторном (красном) канале при прямом возбуждении ( ПИРОГ).В канале наблюдаются импульсы интенсивности флуоресценции).
Поместите 100 мкл реакционных растворов LLPS, содержащих 25 мкМ немеченого мономерного Tau441 (с 25 мкМ αS или без него) в буфере LLPS (дополненном, как указано выше) на несвязывающие 96-луночные микропланшеты с клейким покрытием из фольги, и образование капель проверяли с помощью WF-микроскопии после уравновешивание.в течение 10 мин.Через 48 часов инкубации при комнатной температуре было подтверждено наличие белковых рафтов и пятен.Затем осторожно удалите жидкость над рафтами из лунок, затем добавьте 50 л буфера диссоциации (10 мМ HEPES, pH 7,4, 1 М NaCl, 1 мМ ДТТ) и инкубируйте в течение 10 мин.Высокая концентрация соли гарантирует, что LLPS не будет повторяться из-за остаточного ПЭГ, а возможные белковые сборки, образовавшиеся только за счет электростатических взаимодействий, будут разобраны.Затем дно лунки осторожно соскребали кончиком микропипетки и полученный раствор переносили в пустую наблюдательную лунку.После инкубации образцов с 50 мкМ ThT в течение 1 ч наличие изолированных пятен проверяли с помощью WF-микроскопии.Подготовьте обработанные ультразвуком фибриллы αS, инкубируя 300 мкл раствора αS 70 мкм в PBS с pH 7,4, 0,01% азида натрия при 37 градусах Цельсия и 200 об/мин на орбитальном шейкере в течение 7 дней.Затем раствор центрифугировали при 9600×g в течение 30 минут, осадок ресуспендировали в PBS с pH 7,4 и обрабатывали ультразвуком (1 минута, 50% цикл, 80% амплитуда в ультразвуковом аппарате Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, США) образцы фибрилл. с относительно равномерным распределением мелких фибрилл по размерам.
Анализ FCS/FCCS и обнаружение двухцветных совпадений (TCCD) выполнялись на том же флуоресцентном конфокальном микроскопе с временным разрешением MT200 (Pico-Quant, Берлин, Германия), который использовался для экспериментов по микроскопии FLIM-FRET с использованием режима PIE.Мощность лазера для этих экспериментов была добавлена ​​до 6,0 мкВт (481 нм) и 6,2 мкВт (637 нм).Комбинация этих мощностей лазера была выбрана для обеспечения одинаковой яркости для используемых пар флуорофоров при достижении оптимальной скорости счета и предотвращении фотообесцвечивания и насыщения.Сбор и анализ данных проводили с использованием коммерчески доступного программного обеспечения SymphoTime64 версии 2.3 (PicoQuant, Берлин, Германия).
Образцы изолированных агрегатов αS/Tau, полученных с использованием LLPS, разбавляют в буфере для выделения до соответствующей мономолекулярной концентрации (обычно разведение 1:500, поскольку агрегаты уже находятся в низких концентрациях при выделении из образцов коацервата).Образцы наносили непосредственно на покровные стекла (Corning, США), предварительно покрытые раствором БСА в концентрации 1 мг/мл.
Для анализа PIE-smFRET в зеленом и красном каналах применялся более низкий порог интенсивности в 25 фотонов для фильтрации сигналов низкой интенсивности, вызванных мономерными событиями (обратите внимание, что количество мономеров превышает количество агрегированных образцов по сравнению с изолированными агрегатами).Этот порог рассчитывали как пятикратную среднюю интенсивность мономерного αS, полученную при анализе образцов чистых мономеров, чтобы специально отобрать агрегаты для анализа.Схема возбуждения PIE вместе со сбором данных TSCPC позволила применить весовой фильтр со сроком службы, который помогает устранить фоновые и спектральные перекрестные помехи.Интенсивность вспышки, выбранная с использованием вышеуказанных пороговых значений, была скорректирована с использованием среднего фонового сигнала, определенного из гистограмм появления в зависимости от интенсивности/интервал выборок, содержащих только буфер.Пакеты, связанные с большими агрегатами, обычно занимают несколько последовательных ячеек временной трассы (устанавливается на 1 мс).В этих случаях выбирался бункер максимальной прочности.Для FRET и стехиометрического анализа использовали теоретически определенный гамма-фактор γ (0,517).Спектральные перекрестные помехи и вклады прямого возбуждения незначительны (определено экспериментально) при используемой мощности возбуждающего лазера.Эффективность и стехиометрия FRET при взрыве рассчитывается следующим образом.