Химический компонент гибкой трубы из нержавеющей стали 347. Идентификация новых интерферон-чувствительных белков-шаперонов человеческого лейкоцитарного антигена-А (HLA-A) с использованием сшитой масс-спектрометрии (CLMS).

Благодарим вас за посещение Nature.com.Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Слайдеры, показывающие по три статьи на слайде.Используйте кнопки «Назад» и «Далее» для перемещения по слайдам или кнопки контроллера слайдов в конце для перемещения по каждому слайду.

Описание продукта

Змеевики из нержавеющей стали 347L, марка стали: SS347L

Сигнальная система интерферона индуцирует сильный цитокиновый ответ на широкий спектр патогенных и внутренних патологических сигналов из окружающей среды, что приводит к индукции субпопуляций интерферон-индуцируемых белков.Мы применили масс-спектрометрию перекрестных связей (CLMS), опосредованную DSS, для обнаружения новых белок-белковых взаимодействий в домене белков, индуцированных интерфероном.В дополнение к ожидаемым белкам, индуцируемым интерфероном, мы также идентифицировали новые межмолекулярные и внутримолекулярные сшитые аддукты канонических белков, индуцируемых интерфероном, таких как MX1, USP18, OAS3 и STAT1.Мы сосредоточились на ортогональной проверке нового набора интерферон-индуцируемых белковых сетей, образованных белками HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1), с использованием коиммунопреципитации и их дальнейшем изучении с использованием молекулярно-динамического моделирования.Моделирование конформационной динамики белкового комплекса выявило несколько сайтов взаимодействия, отражающих взаимодействия, выявленные в результатах CLMS.Вместе мы представляем пилотное исследование CLMS для выявления новых сигнальных комплексов, индуцируемых интерфероном, и надеемся на более широкое использование CLMS для выявления новой динамики белковых взаимодействий в микроокружении опухоли.
Прежде чем начнется адаптивный иммунный ответ, врожденная защитная система хозяина вызывает антимикробный ответ, опосредованный семейством секретируемых альфа-спиральных цитокинов, называемых интерферонами (IFN).Классы IFN IFNα и IFNβ активируют клеточные реакции, включая противовирусные, проапоптотические, провоспалительные и антипролиферативные состояния.У человека известно 13 подтипов IFNα, все они сосредоточены на хромосоме 91. Удивительно, но только IFNα2 был изучен для клинического использования.В последнее время особое внимание уделяется исследованиям других подтипов IFNα.Недавнее исследование показало, что IFNα14 является одной из наиболее эффективных изоформ в ограничении репликации HBV2 и ВИЧ-13,4 по сравнению с каноническим подтипом IFNα2.
Установлено, что активированные рецепторные комплексы интерферона I типа (IFNAR1 и IFNAR2) запускают каскад передачи сигнала, опосредованный янус-киназами TYK2 и JAK15,6.Эти Янус-киназы фосфорилируют преобразователи сигналов и активаторы транскрипционных белков (STAT1 и STAT2) по остаткам тирозина, чтобы инициировать гетеродимеризацию, опосредованную доменом SH26.Впоследствии IRF9 связывает гетеродимеры STAT с образованием тримерного комплекса гена IFN-стимулируемого фактора 3 (ISGF3), который транслоцируется в ядро ​​и индуцирует транскрипцию более 2000 интерферон-стимулируемых генов (ISG)5,6,7,8.
ISG составляют основу врожденной иммунной системы, особенно в ответ на вирусную атаку.В качестве первой линии защиты от вирусной инфекции клетки быстро задействуют обширные взаимодействия клеточных белков с широким спектром биологической активности.К этим белкам относятся рецепторы распознавания образов, сигнальные молекулы, факторы транскрипции и белки с прямыми противовирусными функциями, а также негативные регуляторы иммунных ответов9.Большая часть информации об активности ISG поступает в результате функциональных скринингов с использованием скринингов сверхэкспрессии10,11 или методов подавления генов (siRNA, RNAi и CRISPR)12,13, при которых отдельные ISG экспрессируются или ингибируются, а их активность тестируется на различных вирусах.Хотя эти исследования определили противовирусные свойства отдельных ISG, основные молекулярные механизмы каждого ISG остаются в значительной степени неизвестными.Принято считать, что многие белки взаимодействуют с одним или несколькими цитокинами для обеспечения полной активности, поэтому либо ISG взаимодействуют напрямую, либо их взаимодействия опосредуются клеточными белками.Например, недавнее фотосшитое протеомное исследование идентифицировало ATPase VCP/p97 как основного партнера по взаимодействию IFITM3, чье ингибирование приводит к дефектам лизосомальной сортировки, оборота и совместного транспорта IFITM3 с вирусными частицами 14 .Используя иммунопреципитацию, мы идентифицировали VAPA, белок, связанный с везикулами, как партнера по взаимодействию с IFITM1/2/3, который опосредует опосредованное холестерином созревание вируса, и это было подтверждено другим исследованием с использованием дрожжевой двухгибридной системы.Научное обеспечение 15 , 16 .
Фундаментальным биологическим процессом, участвующим в подавлении инфекции и злокачественной трансформации, является презентация антигена, которая опосредуется молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC).Пептиды (длиной 8-12 аминокислот) из расщепленных, преждевременно терминированных или неправильно свернутых белков загружаются в гетеродимер MHC-I (состоящий из тяжелых и легких цепей MHC-I, называемый β-2-микроглобулином; β2M) 17,18 .Полученные стабильные тримеры MHC-I транспортируются на поверхность клетки, где они представляют внутриклеточные пептиды CD8+ Т-клеткам (цитотоксическим Т-клеткам)17.Т-клетки распознают и уничтожают эти патогены и клетки, несущие опухолеспецифический антиген.Следовательно, патогены и опухолевые клетки часто подавляют процесс презентации антигена, чтобы избежать иммунного надзора.Кроме того, уровень MHC-I снижается в 40–90% опухолей человека и часто связан с худшим прогнозом19.
Гены, участвующие в реакции на патогены, должны быстро переключаться между состоянием покоя и состоянием активной транскрипции.Таким образом, предполагается, что несколько клеточных белков участвуют в ответе на высокую потребность в IFN в течение коротких периодов времени, включая ремоделирование и модификацию промотора хроматина 20,21 .Большинство исследований было сосредоточено на идентификации отдельных белков-партнеров ISG в присутствии IFN.Несколько протеомных и транскриптомных исследований на модельных клеточных системах выявили влияние интерферона на клеточный ландшафт.Однако, несмотря на растущее понимание динамики, вызываемой интерферонами, мы все еще мало знаем об участии ISG.При рассмотрении сложности и зависящей от времени динамики передачи сигналов интерферона возникают два вопроса: (i) возможно ли стабилизировать и поймать мультибелковые комплексы, участвующие в быстрой передаче сигналов, и (ii) можно ли отобразить эти взаимодействия в трехмерном пространстве?
Чтобы решить эти проблемы, мы применили химическое сшивание, опосредованное субератом дисукцинимида (DSS), в сочетании с масс-спектрометрией (CLMS) для изучения сети взаимодействия белков, индуцированной IFNα, и ее динамики.DSS добавляет ковалентные связи между проксимальными остатками белков и/или белковых комплексов in vivo.Последующий МС-анализ выявляет специфические сайты сшивки, которые отражают пространственную близость областей внутри конкретного белка, называемых внутренними связями, или субъединиц в белковых комплексах, называемых взаимосвязями.Используя этот подход, мы идентифицировали несколько новых белково-белковых комплексов, а также сети мультибелковых взаимодействий, индуцированные интерфероном.Путем дальнейшего тестирования подмножества этих новых взаимодействий мы продемонстрировали, что H2BFS (FS гистонового типа H2B; в дальнейшем именуемый H2B) и MDN1 действуют как партнеры по связыванию для HLA-A.
Клетки Flo-1 являются одной из наиболее известных моделей аденокарциномы пищевода in vitro, поскольку они имитируют ключевые особенности опухолей пищевода22,23.Однако не все опухоли иммуногенны, и чтобы определить, реагируют ли клетки Flo-1 на лечение интерфероном, мы обрабатывали клетки Flo-1 10 нг/мл IFNα в течение 72 часов.Клетки Flo-1 демонстрировали раннюю индукцию pSTAT1 и IRF1, начиная через 2 часа после обработки и продолжаясь в течение 72 часов, с зависимым от времени снижением стационарных уровней IRF1 (рис. 1А).Было обнаружено, что ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 и ISG15) сильно индуцируются через 6 часов, имитируя классические реакции средней и поздней фазы на IFNα (рис. 1А).В совокупности эти данные позволяют предположить, что эту клеточную модель можно использовать для изучения реакции интерферона.
Ответы на дифференциальную экспрессию белка в клетках Flo-1 после обработки IFNα.(А) Экспрессию белка в клетках Flo-1, обработанных 10 нг/мл IFNα в течение 2, 6, 24, 48 и 72 часов, анализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием указанных антител ISG.(B) Окрашенные кумасси синим гели SDS-PAGE экстрактов цельных клеток после перекрестного связывания с DSS в течение указанного времени и концентраций.(C) Репрезентативный иммуноблоттинг с использованием антитела p53(DO-1) из тех же образцов для оценки степени перекрестного связывания белков.
Чтобы оценить картину взаимодействия белков in situ, мы использовали DSS, широко используемый сшивающий агент из-за его высокой мембранной проницаемости и относительно короткого времени реакции.Более короткое время реакции помогает предотвратить образование крупных агрегатов сшитых белков, тем самым сохраняя стабильность сшивающего агента.Чтобы определить оптимальную концентрацию DSS и избежать чрезмерного сшивания, мы сначала подвергли клетки воздействию 5, 2,5 и 1 мМ DSS в течение 5, 10, 5 и 30 минут соответственно и проанализировали лизаты с помощью SDS-PAGE, окрашенного Кумасси. (данные не показаны) .Клеточные лизаты оказываются сильно сшитыми при самой низкой концентрации и в кратчайшие сроки.Поэтому DSS титровали до 1, 0,5 и 0,1 мМ в течение 5 минут (рис. 1B).Оптимальное сшивание наблюдалось при использовании 0,5 мМ DSS в течение 5 минут, и эти условия были выбраны для клеток, обработанных IFNα.Кроме того, на рисунке 1C показан вестерн-блоттинг, выполненный с использованием антитела p53 (DO-1) для оценки степени перекрестного связывания белков.
Клетки Flo-1 обрабатывали 10 нг/мл IFNα в течение 24 часов перед добавлением сшивающего агента.Сшитые клетки впоследствии лизировали посредством двухэтапного протеолиза, а белки обрабатывали с помощью FASP (рис. 2)24,25.Сшитые триптические пептиды анализировали методом масс-спектрометрии (рис. 2).Спектры МС/МС затем сопоставляются с последовательностью белка и количественно оцениваются с помощью MaxQuant26,27.Сшитые пептиды идентифицировали по полученным спектрам с помощью программы SIM-XL, а отдельные соединения объединяли в сложную сеть с помощью конвейеров вычислительного программного обеспечения с открытым исходным кодом xQuest28 и SIM-XL29 (рис. 2).SIM-XL идентифицирует белок-белковые взаимодействия, внутренние цепи и отдельные цепи в простых или сложных белковых смесях и предоставляет сценарии для визуализации взаимодействий в белковых структурах.Кроме того, он ранжирует каждую перекрестную ссылку как показатель идентификатора в соответствии с качеством спектра MS/MS29.Было идентифицировано несколько высоконадежных белок-белковых взаимодействий и комплексов, а новый набор взаимодействий был дополнительно исследован с использованием коиммунопреципитации и конформационных изменений комплексов с использованием молекулярно-динамического (МД) моделирования (рис. 2) 30, 31.
Схематический обзор метода CLMS.Клетки Flo-1 обрабатывали 10 нг/мл IFNα в течение 24 часов с последующим сшиванием белков in situ с использованием DSS с последующим лизисом клеток и трипсинизацией.Сшитые образцы анализировали с использованием масс-спектрометра Orbitrap и дополнительно отбирали образцы на предмет фрагментации предшественников пептидов во время ЖХ-МС/МС.Два связанных пептида были идентифицированы из полученных спектров с использованием программы Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL), и все соединения были объединены в сложную сеть с помощью вычислительных конвейеров.Отфильтруйте взаимодействия с низким уровнем достоверности на основе показателей ложноположительных результатов (FDR).Несколько новых высокоточных белок-белковых взаимодействий были дополнительно подтверждены с помощью коиммунопреципитации, а конформационные изменения в комплексах были изучены с использованием молекулярно-динамического (МД) моделирования.
Всего с помощью MaxQuant было обнаружено ~30 500 и ~ 28 500 пептидов в нестимулированных и стимулированных образцах IFNα соответственно (дополнительная таблица S1, рис. 3A).Распределение длин пептидов в обоих случаях показало более высокую долю более крупных пептидов, что указывает на наличие сшитых пептидов (рис. 3B,C).Кроме того, большая доля более крупных пептидов присутствовала в диапазоне 40–55 в образцах, обработанных IFNα (рис. 3C).Картирование белков в зависимости от интенсивности log2 показало, что классические интерферон-стимулированные белки были наиболее распространены по сравнению с необработанными образцами, включая MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 и HLA-F (рис. 3D).Анализ путей белков, более чем в три раза обогащенных в ответ на лечение IFNα, с использованием базы данных путей Reactome показал, что презентация и процессинг антигена, опосредованные MHC-I, были наиболее доминирующим путем (рис. 3E).В соответствии с более ранними сообщениями, противовирусные ответы, опосредованные OAS и ISG15, а также IFNα/β и передачей сигналов цитокинов, были среди активированных путей.Кроме того, по первоначально полученным спектрам МС/МС с использованием SIM-XL были идентифицированы перекрестные связи белков, специфичных для лизина и серина.В недавнем исследовании сообщалось о 104 ISG, охватывающих 20 вирусов из 9 классов вирусов, путем метаанализа отдельных исследований сверхэкспрессии ISG в 5 типах клеток9.Однако, чтобы преодолеть вычислительные ограничения скрининга больших наборов данных, мы начали с меньшего набора данных, чтобы изучить возможные взаимодействия между списком генов IRDS, о которых сообщил Падария и др., Большинство из которых являются ISG.
Идентификация дифференциально экспрессируемых сшитых белков в ответ на IFNα (данные получены из MaxQuant).(A) Диаграмма Венна, показывающая количество общих и эксклюзивных пептидов, идентифицированных в обработанных IFNα14 и необработанных образцах Flo-1.Распределение пептидов по длине в необработанных (B) и обработанных IFNα (C) сшитых образцах.(D) Тепловая карта, представляющая log2 (интенсивность LFQ) между необработанными и обработанными IFNα14 клетками Flo-1.На левой панели показаны белки, наиболее активно активируемые в присутствии IFNα.(E) Гистограмма, представляющая 20 основных путей обогащения после лечения IFNα.База данных путей Reactome проанализировала более чем четырехкратные изменения в белках, реагирующих на IFNα.
Стимуляция ISG, опосредованная интерфероном, хорошо документирована, но на молекулярном уровне плохо понятно, как эти белки выполняют широкий спектр биологических функций.Мы исследовали белковые взаимодействия с высокой степенью достоверности между известными ISG.Интересно, что мы идентифицировали сеть, включающую белки MX1, USP18, ROBO1, OAS3 и STAT1, которые образуют большой комплекс в ответ на лечение IFNα (рис. 4, таблица S2) 32,33,34.Самое главное, что эти взаимодействия были обнаружены во всех трех экземплярах, обработанных IFNα, и не были обнаружены в необработанных образцах, что позволяет предположить, что они сформировались специально в ответ на лечение IFNα.Известно, что STAT1 транскрипционно регулирует экспрессию этих ISG, однако его взаимодействие с ISG на уровне белка не изучено.Кристаллическая структура STAT1 показала, что его спиральный домен (CCD) не участвует во взаимодействии с ДНК или протомерами при образовании димеров35.Эти α-спирали образуют спирально-спиральную структуру, которая обеспечивает преимущественно гидрофильную поверхность для возникновения взаимодействий 35 .В наших данных CLMS мы заметили, что большинство взаимодействий с STAT1 происходило в домене SH2, предшествующем CCD, линкерном домене или C-концевом хвосте (остатки 700-708) (рис. 4A).Предыдущее исследование показало, что USP18 связывается с CCD и ДНК-связывающим доменом (DBD) STAT2 и рекрутируется в субъединицу рецептора интерферона типа I IFNAR2, чтобы опосредовать ингибирование передачи сигналов интерферона типа I 24 .Наши данные также показали, что каталитический домен USP18 взаимодействует с DBD STAT1 (рис. 4A, D), что позволяет предположить, что и STAT1, и STAT2 могут играть роль в привлечении USP18 к IFNAR2.
Белково-белковая сеть ISG идентифицирована в сшитых клетках, обработанных IFNα.(A) График двумерного взаимодействия, показывающий белок-белковые взаимодействия (созданный в программе SIM-XL), с линиями, представляющими межмолекулярные взаимодействия (отсечение поперечных связей установлено на 3,5).Домены различной идентичности отмечены цветом32: домен MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) и GED (569–660).Домены OAS3: OAS1_C (160–344), OAS1_C (559–745), NTP_transf_2 (780–872) и OAS1_C (903–108).Домен ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) и fn3 (777–864).Поля STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) и STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Круговой просмотрщик сшитых белков (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 и STAT1) с взаимодействиями и взаимодействиями, отмеченными синим и красным цветом соответственно.Порог перекрестных связей был установлен на уровне 3,5.Точечные графики указывают сайты взаимодействия STAT1 с MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) и OAS3 (F), а также сайты взаимодействия K или S между двумя пептидами.На рисунке порог оценки перекрестных связей установлен на 3,0.(G) Различные сайты взаимодействия между доменами DI STAT1 и OAS3, наложенные на их белковые структуры в PyMol (система молекулярной графики PyMOL, версия 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (идентификатор базы данных: 1bf533) и OAS3 (идентификатор базы данных: 4s3n34).) программа.
У человека описаны две изоформы USP18: полноразмерный белок, который преимущественно локализован в ядре, и изоформа без N-концевого домена, USP18-sf, которая равномерно распределена в цитоплазме и ядре 36 .Кроме того, было предсказано, что N-конец неструктурирован и не требует активности изопептидазы или связывания ISG1537.Большинство взаимодействий, выявленных в нашем исследовании, были расположены на N-конце белка, что позволяет предположить, что эти взаимодействия включают полноразмерный USP18 (рис. 4A,D) и, таким образом, вероятно, происходят в ядре.Более того, наши данные также показывают, что N-конец специализируется на межбелковых взаимодействиях.Сайт связывания IFNAR2 расположен между остатками 312-368, и примечательно, что ни один из белков комплекса не связывается с этой областью (Рис. 4А) 37,38.В совокупности эти данные показывают, что связывающий домен IFNAR2 используется исключительно рецепторным белком.Кроме того, было обнаружено, что только OAS3 и ROBO1 связаны с доменами выше N-конца и сайта связывания IFNAR2 (рис. 4A).
ROBO1 принадлежит к суперсемейству трансмембранных сигнальных молекул иммуноглобулинов (Ig) и состоит из пяти доменов Ig и трех доменов фибронектина (Fn) во внеклеточной области.За этими внеклеточными доменами следуют проксимальная к мембране область и одна трансмембранная спираль 39. Неструктурированная внутриклеточная область расположена на С-конце и содержит мотивы консервативной последовательности, которые опосредуют связывание эффекторных белков 39.Область от аминокислот ~1100 до 1600 преимущественно неупорядочена.Мы обнаружили, что MX1 взаимодействует с ROBO1 через Ig, Fn и внутриклеточные домены, тогда как большинство взаимодействий с STAT1 происходит между его CCD, линкерным доменом и C-концом ROBO1 (рис. 4A,E).С другой стороны, взаимодействия с линкерными областями DI, DIII и OAS3 были распределены по всему белку ROBO1 (рис. 4А).
Семейство белков oligoadenylate Synthase (OAS) принимает и связывает внутриклеточную двухцепочечную РНК (dsRNA), претерпевает конформационные изменения и синтезирует 2',5'-связанные олигоаденилаты (2-5 As) 40 .Было обнаружено, что среди трех OAS OAS3 проявляет самое высокое сродство к dsRNA и синтезирует наименьшее количество 2-5 As, которые могут активировать RNase L и тем самым ограничивать репликацию вируса 41 .Семейство OAS состоит из доменов трансферазы нуклеотидов, подобных полимеразе бета (pol-β).Предыдущие исследования показали, что каталитическая активность С-концевого домена (DIII) зависит от дцРНК-связывающего домена (DI), который необходим для активации OAS342.Мы заметили, что домены DI и DII OAS3 взаимодействуют с CCD и небольшой областью соединения между SH2 и STAT1 TAD (рис. 4A,F).Наложение различных сайтов сшивки на структуру белка выявило взаимодействие между β-листом и петлей DBD STAT1 и открытым карманом или полостью, образованной остатками 60–75 в DI-домене OAS3 (рис. 4G).Ориентация белков в комплексе также указывала на то, что ни одно из взаимодействий с OAS3 не мешало ДНК-связывающей способности его домена DI (рис. S1A).Кроме того, N-концевой домен ГТФазы MX1 активно взаимодействует с доменами DI и DIII OAS3 (рис. 4А).Мы также наблюдали взаимодействие между OAS1 и MX1 во всех трех повторах, обработанных IFNα, где один домен OAS1 (также каталитически активный) взаимодействовал со всеми тремя доменами MX1 (рис. S2A,B).
Белки MX являются частью большого семейства динеинподобных ГТФаз, которые содержат N-концевой домен ГТФазы, который связывает и гидролизует ГТФ, промежуточный домен, который опосредует самосборку, и С-концевую лейциновую застежку, которая действует как ГТФаза (LZ ).эффекторный домен25,43.MX1 связывается с субъединицами вирусных полимераз, блокируя транскрипцию вирусного гена43.Ранее сообщалось, что двухгибридный скрининг дрожжей показал, что MX1, связанный с PIAS1, ингибирует STAT1-опосредованную активацию гена, блокируя ДНК-связывающую активность, а также обладает лигазной активностью SUMO E344,45.Здесь мы демонстрируем, что MX1 связывается со STAT1 (рис. 4C, D), однако то, как это взаимодействие влияет на опосредованную STAT1 активацию гена в ответ на IFNα, требует дальнейшего изучения.Кроме того, мы также обнаружили, что MX1 взаимодействовал с IFIT3 и DDX60 во всех трех повторах, обработанных IFNα (рис. S2C).
DDX60 представляет собой цитоплазматическую геликазу, индуцированную IFN, о которой ранее сообщалось, что она играет роль в RIG-I-независимой деградации вирусной РНК46.Он взаимодействует с RIG-I и активирует его передачу сигналов лиганд-специфичным образом 46. DDX60 состоит из хеликазного домена DEXD/H-Box и C-концевого хеликазного домена, которые связывают вирусную РНК и ДНК47.Большая часть его взаимодействий с MX1 и IFIT3 происходит в длинных N- и C-концевых областях без канонических доменов или мотивов (рис. S2E,F).Однако MX1 также связан с хеликазным доменом DEXD/H-Box (рис. S2E).Белки семейства IFIT имеют тандемные копии характерного мотива спираль-поворот-спираль, называемого тетрапептидным повтором (TPR).Было обнаружено, что IFIT3 является положительным модулятором передачи сигналов RIG-I и, следовательно, компонентом комплекса MAVS.В совокупности наши данные показывают, что IFIT3 и DDX60 взаимодействуют преимущественно в области между TPR 3–6 IFIT3 и могут играть роль в передаче сигналов RIG-I/MAVS (рис. S2F).
Учитывая, что скрининг всего протеома требует больших вычислительных ресурсов, мы затем проверили всю базу данных UniProt человека на наличие одного из повторов, обработанных IFNα.В этой реплике мы обнаружили несколько высоконадежных сетей взаимодействия HLA-A.Анализ белковых путей, выявленных с помощью спектров МС/МС, показал, что процессинг и презентация антигена на основе MHC-I является основным путем, индуцируемым интерфероном (рис. 3D).Поэтому мы сосредоточились на изучении белковых взаимодействий молекул MHC-I с высокой степенью достоверности во всех сшитых образцах.HLA состоит из доменов α1, α2 и α3 и легких цепей, а микроглобулин β2 (β2m) является постоянным белком-шапероном49.После сборки в эндоплазматическом ретикулуме HLA становится нестабильным в отсутствие пептидных лигандов50.Пептидсвязывающая бороздка образована высокополиморфными и неструктурированными доменами α1 и α2 в непептидной форме и относительно менее полиморфным доменом α351.В присутствии IFNα мы обнаружили два комплекса HLA-A: один взаимодействует с HMGA1 и H2B (рис. 5, таблица S3), а другой взаимодействует с MDN1, LRCH4 и H2B (рис. 6).
IFNα индуцирует сеть взаимодействия HLA-A с H2B (H2BFS) и HMGA1.(A) 2D-график (созданный в программном обеспечении SIM-XL), изображающий различные типы взаимодействий в комплексе H2B-HLA-A-HMGA1: межсвязь (синий), межсвязь (красный) и одиночная ссылка (черный)..Домены различной идентичности имеют цветовую кодировку32: H2B (гистон; 2–102) и MHC-I (MHC_1; 25–203, группа C1; 210–290 и MHC_I_C; 337–364).Порог перекрестных связей был установлен на уровне 3,5.Точечные графики указывают сайты взаимодействия HLA-A с H2B (B) и HMGA1 (C), а также сайты взаимодействия K или S между двумя пептидами.На рисунке порог оценки перекрестных связей установлен на 3,0.(D) Отношения между белками, показанные в структурах белков H2B, HLA-A и HMGA1 в программе PyMOL.Эти структуры были смоделированы с использованием сервера Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), а матричные структуры для белков H2B, HLA-A и HMGA1 представляли собой 1kx552, 1kj349 и 2eze55 соответственно.
IFNα индуцирует сеть взаимодействия HLA-A с H2B (H2BFS), MDN1 и LRCH4.(A) Внутримолекулярные (красный) и межмолекулярные (синий) сшивки представлены на интерактивной 2D-карте (созданной в программном обеспечении SIM-XL), где MDN1 представлен в виде круга.Порог перекрестных связей был установлен на уровне 3,5.Домены различной идентичности имеют цветовую кодировку32: H2B (гистон; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, группа C1; 210–290 и MHC_I_C; 337–364) и LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) и CH (535–641)).(Б) Взаимосвязи между белками, показанными в структурах белков H2B, HLA-A, LRCH4 и MDN1 в программе PyMOL.Эти структуры были смоделированы с использованием сервера Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) с матричными структурами 1kx552, 1kj349, 6hlu62 и 6i2665 для белков H2B, HLA-A, LRCH4 и MDN1. соответственно.Точечные графики показывают сайты взаимодействия K или S для HLA-A с H2B (C), LRCH4 (D) и MDN1 (E).Для графиков порог оценки перекрестных связей был установлен на 3,0.
Помимо поддержания целостности генома, гистон H2B также участвует в регуляции транскрипции.Белок H2B состоит из центрального гистонового домена (HFD), образованного тремя α-спиралями, разделенными петлями, и C-концевого хвоста 41,52.Большая часть взаимодействия с H2B происходит в спирали α1, обеспечивающей тримеризацию с гетеродимером HFD (рис. 5А,Б).Хотя лизины участвуют в связывании ДНК, некоторые лизины также являются альтернативными сайтами ацетилирования или метилирования.Например, остатки К43, К46 и К57 из H2B не участвуют в прямом связывании ДНК, но являются мишенями различных посттранскрипционных модификаций53.Аналогично, остатки К44, К47 и К57 в H2B могут играть альтернативную роль в присутствии IFNα, в том числе при взаимодействии с другими белками (рис. 5А, Б).Кроме того, внехромосомный гистон H2B активирует иммунный ответ в различных типах клеток, действуя как цитозольный сенсор для обнаружения фрагментов двухцепочечной ДНК (дцДНК), полученных из инфекционных агентов или поврежденных клеток54.В присутствии ДНК-вирусов истощение H2B ингибировало выработку IFN-β и фосфорилирование STAT154.Также известно, что H2B перемещается в ядро ​​и из него быстрее, чем другие коровые гистоны54.Взаимодействие H2B с MDN1 и LRCH4 также наблюдалось в отдельных необработанных образцах.Мы обнаружили, что HLA-A взаимодействовал с H2B во всех трех образцах, обработанных IFNα, и в одном необработанном повторном образце.Эти данные отражают роль H2B в альтернативной физиологической функции, независимой от регуляции транскрипции.
HMGA1 (группа AT-Hook 1 с высокой подвижностью), небольшой нуклеопротеин, богатый аминокислотами, способствующими развитию заболевания, был идентифицирован в ассоциации с HLA-A.Он имеет кислый С-концевой хвост и три отдельных DBD, называемых АТ-крючками, поскольку они связываются с малой бороздкой богатой АТ области в дцДНК55,56.Это связывание заставляет ДНК изгибаться или выпрямляться, позволяя каноническим факторам транскрипции получить доступ к ее консенсусной последовательности.Считается, что С-концевой хвост участвует в белок-белковых взаимодействиях и рекрутировании транскрипционных факторов, поскольку мутанты с делецией С-конца не способны инициировать транскрипцию57.Более того, этот домен содержит несколько консервативных сайтов фосфорилирования, которые являются известными субстратами для киназ 58 .Мы наблюдали взаимодействия HLA-A и H2B с HMGA1 вне C-концевого домена, что позволяет предположить, что C-концевой домен в основном используется для связывания транскрипционных факторов (рис. 5A, C).Белки HMGA конкурируют с гистоном H1 за связывание с адаптерной ДНК, тем самым увеличивая доступность57.Аналогичным образом кажется вероятным, что HMGA взаимодействует с гистоном H2B вдоль линкерной ДНК, конкурируя с гистоном H1.HMGB1 индуцирует экспрессию HLA-A, -B и -C в дендритных клетках, что приводит к их активации59, но о взаимодействии между HMG и HLA ранее не сообщалось.Мы обнаружили, что HMGA1 взаимодействует с доменами α1 и α3 HLA-A, причем большая часть взаимодействий находится за пределами его 3 DBD (рис. 5A,C).В наших исследованиях было обнаружено, что HLA-A локализуется в ядре (данные не показаны), а учитывая, что H2B и HMGA1 также присутствуют в ядре, это взаимодействие, вероятно, происходит именно в ядре.Специфические аддукты, измеренные между H2B, HLA-A и HMGA1, показаны на рисунке 5D.
Большинство взаимодействий HLA-A с другими белками происходит внутри его доменов α1 и α2, а также неупорядоченного С-концевого домена (рис. 6).В одном из этих примеров мы обнаружили, что HLA-A взаимодействует с неупорядоченным N-концевым хвостом LRCH4 (рис. 6A,D).LRCH4 регулирует активацию TLR4 и индукцию цитокинов LPS, тем самым модулируя врожденный иммунный ответ60,61.Это мембранный белок с девятью лейцин-богатыми повторами (LRRs) и мотивом гомологии кальмодулина (CH) в его эктодомене, за которым следует трансмембранный домен (TMD) 60,62 .Сообщалось, что CH-домены опосредуют белок-белковые взаимодействия 60 .Участок длиной около 300 аминокислот между доменами LRR и CH относительно доступен, но неупорядочен.Основываясь на функции неупорядоченных областей как медиаторов белок-белковых сетей и везикулярного транспорта 63 , мы обнаружили, что большинство белковых взаимодействий происходит в неупорядоченных областях.Взаимодействия с MDN1 были распределены по всей длине белка, включая домены LRR1, LRR6, CH и случайные области, тогда как H2B преимущественно связывался с доменом CH (рис. 6А, Б).Примечательно, что ни одно из взаимодействий не включало ВНЧС, что указывает на специфичность подхода CLMS (рис. 6A, B).
MDN1 также был идентифицирован как часть белковой сети HLA-A (рис. 6А).Он принадлежит к семейству белков ААА (АТФаз, связанных с различной активностью).Это тот же N-концевой домен ААА, который организуется в гексамерное кольцо и удаляет фактор сборки из субъединицы 60S 64 рибосомы.похоже на динеин64,65,66.Кроме того, за областью, богатой Asp/Glu, следует домен MIDAS (сайт, зависимый от ионов металлов).Из-за большого размера MDN1 (около 5600 аминокислот) и его ограниченной гомологии с хорошо изученными белками мало что известно о его структуре и функциях у человека.Мы идентифицировали HLA-A, H2B и LRCH4 как партнеров по связыванию MDN1 и выявили их ориентацию в виде белковых комплексов в PyMol (рис. 6A,B).Эти три белка взаимодействуют с доменом AAA, динеинподобным линкерным доменом и, возможно, доменом MIDAS MDN1.В предыдущем отчете аффинная очистка белков-приманок идентифицировала MDN1 как белок, связанный с гистоном H2B67.Кроме того, недавнее исследование также сообщило о взаимодействии между MDN и HLA-B в клетках HCT116 с использованием аффинно-очищенной масс-спектрометрии, что подтверждает наши выводы68.Идентификация этого комплекса в образцах, обработанных IFNα, предполагает роль MDN1 в передаче сигналов интерферона.
Поскольку гены HLA высоко полиморфны, мы извлекли прочтения секвенирования, картирующие HLA-A, -B и -C, из данных секвенирования РНК клеток Flo-1 (данные не показаны).Пептидные последовательности, соответствующие показаниям секвенирования, выявили значительные различия между HLA-A, -B и -C в областях, где сшитые пептиды были расположены в HLA-A (рис. S3).Кроме того, мы не наблюдали межбелкового сшивания молекул HLA-B/C с белками H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Это говорит о том, что белковое взаимодействие, обнаруженное между HLA-A, MDN1, LRCH1 и HMGA1, является HLA-A-специфичным.Кроме того, протеомный анализ несшитых образцов (таблица S4) показал, что HLA-A имеет более высокий охват последовательностей по сравнению с HLA-B или HLA-C.Пептиды, идентифицированные для HLA-A, имели высокую интенсивность как в обработанных IFNα, так и в необработанных образцах.
Чтобы гарантировать, что выявленные здесь взаимодействия не были вызваны неспецифическим перекрестным сшиванием двух белков, находящихся в непосредственной пространственной близости, мы дополнительно подтвердили два новых фактора взаимодействия HLA-A, выполнив анализы совместной иммунопреципитации.Взаимодействия HLA-A с эндогенными MDN1 и H2B были обнаружены как в обработанных IFNα, так и в необработанных клетках Flo-1 (рис. 7, рис. S4).Мы подтвердили, что HLA-A захватывался H2B в иммунопреципитатах и ​​что эта ассоциация была обусловлена ​​обработкой IFNα, поскольку HLA-A отсутствовала в образцах иммунопреципитата из необработанных клеток (рис. 7A).Однако наши данные показывают, что IFNα по-разному регулирует связывание HLA-A с H2B и MDN1.IFNα индуцирует ассоциацию между H2B и HLA-A, но снижает ее связь с MDN1.Мы обнаружили, что MDN1 был связан с HLA-A в контрольной группе, а добавление IFNα уменьшало это взаимодействие независимо от индукции MDN1 IFNα (рис. 7B,C).Кроме того, иммунопреципитация HLA-A захватила H2B в клетках A549 (рис. S4), что позволяет предположить, что это взаимодействие не зависит от типа клеток.В совокупности эти результаты подтверждают опосредованное интерфероном взаимодействие HLA-A с H2B и MDN1.
HLA-A совместно очищает H2B и MDN1.Репрезентативные эндогенные иммуноблоты H2B (A) и MDN1 (B) иммунопреципитировали из обработанных IFNα клеток Flo-1 и исследовали на наличие указанных антител.В качестве отрицательного контроля использовали мышиные и кроличьи IgG.(C) Относительные количества (вход) различных антигенов показаны с помощью иммуноблотов, зондированных против указанных антител, β-актин использовался в качестве контроля нагрузки.
Исследованы структурные свойства одной из высоконадежных сшитых сетей, индуцированных интерфероном, H2B-HLA-A-HMGA1.Мы использовали моделирование молекулярной динамики в качестве альтернативного подхода для понимания конформационной динамики белков, участвующих в этом комплексе (рис. 8).Выводы из данных CLMS позволяют предположить возможность различных конформаций белков H2B, HLA-A и HMGA1.Таким образом, в среде растворителя были смоделированы следующие потенциальные комплексы: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A и H2B-HLA-A-HMGA1.Первоначальный скрининг стыковки белков с использованием пакета MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада) показал возможные конформации, которые различаются между этими белками (рис. 8А).Визуализация комплекса стыковочных белков выявила несколько взаимодействий и возможных конформаций (рис. 5А, 8).Таким образом, одна возможная конформация показана на рисунке 8А (с помеченными поперечными связями), и она была дополнительно оценена с использованием конвейера моделирования MD.Кроме того, связывание H2B или HMGA1 с HLA-A подчеркивает более высокое сродство H2B к HLA-A (рис. 8А).
Конформационная динамика возможных сетей между комплексами H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A и H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Левая панель представляет собой 2D-карту (созданную в программном обеспечении SIM-XL) внутримолекулярных (красный) и межмолекулярных (синий) поперечных связей (предельное значение поперечных связей установлено на 3,5).Кроме того, идентифицированные сшивающие остатки помечены на структурах белков H2B, HLA-A и HMGA1.Соответствующие конформации этих белков были выделены с помощью стыковочного конвейера, реализованного в пакете MOE.На нижней левой панели показаны различные возможные конформации комплексов H2B-HLA-A и HMGA1-HLA-A с различной аффинностью связывания белок-белок (GBVI/WSA dG; ккал/моль).(B) Стандартное отклонение (RMSD) атомных положений (исключая атомы водорода) для каждой структуры белка.(C) Межмолекулярные взаимодействия водородных связей белок-белок из различных смоделированных комплексов с учетом специфических взаимодействий длительностью ≥ 10 нс.Расстояние отсечки донор-акцептор h-связи было установлено равным 3,5 Å, а угол отсечки донор-H-акцептор был установлен на ≥ 160–180 °.(D) Меченые остатки, образующие белок-белковые взаимодействия HLA-A со своими соответствующими партнерами, охватывающие ≥ 20 нс, извлеченные из фиктивных комплексов HLA-A-H2B и HLA-A-HMGA1.Белковые структуры представляют собой среднюю структуру MDS длиной 100 нс.(E) Взаимодействия между комплексами HLA-A-H2B и HLA-A-HMGA1 по сравнению с взаимодействиями, отслеживаемыми с помощью моделирования H2B-HLA в течение 100 нс на основе сайта взаимодействия K или S между двумя пептидами.Комплексы /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Пороговое значение для оценки поперечных связей было установлено равным 3,0, и учитывались специфические взаимодействия МДС длительностью ≥ 10 нс.Белковые структуры визуализировали с использованием пакетов BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., Сан-Диего, Калифорния, США) и Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада).
Стабильность молекул HLA-A с течением времени (стандартное отклонение; RMSD или стандартное отклонение; RMSF) указывала на то, что присутствие белков H2B или HMGA1 в комплексах стабилизировало HLA-A (рисунок 8B, рисунок S5).Белок HMGA1 прочно связывается с сайтом B2M HLA-A, индуцируя стабильность аминокислот HLA-A в комплексе HLA-A-HMGA1 или H2B-HLA-A-HMGA1 (рис. 8B, рис. S5).в частности, остатки HLA ~60-90 и ~180-210 оказались менее гибкими в присутствии H2B (фиг. 8B).H2B и HMGA1 показали лучшее связывание с HLA-A в комплексе H2B-HLA-A-HMGA1 по сравнению со связыванием HLA-A только с H2B или HMGA1 (рис. 8C, D; таблица S5).Остатки, участвующие в образовании водородных связей (моделированная МД высокая заселенность ≥ 10 нс), совпадают с сайтами взаимодействия CLMS (остатки K или S) в комплексе, что позволяет предположить, что взаимодействия, идентифицированные с помощью CLMS, очень надежны.Надежность (рис. 8Д).При моделировании CLMS и MD было обнаружено, что остатки HLA-A между примерно 190-210 и примерно 200-220 аминокислотами связывают H2B и HMGA1 соответственно (фиг. 8E).
Белково-белковые взаимодействия образуют динамические структурные сети, которые опосредуют внутриклеточную связь в ответ на определенные стимулы.Поскольку многие подходы протеомики обнаруживают изменения в общем уровне устойчивого состояния белка, динамика межбелкового взаимодействия требует дополнительных инструментов для захвата интерфейсов связывания, и CLMS является одним из таких инструментов.Сигнальная система интерферона представляет собой цитокиновую сеть, которая позволяет клеткам реагировать на ряд патогенных и внутренних патологических сигналов окружающей среды, что приводит к индукции подмножества интерферон-индуцируемых белков.Мы применили CLMS, чтобы определить, можно ли идентифицировать новые белок-белковые взаимодействия среди группы белков, индуцированных интерфероном.Для захвата белковых комплексов использовали анализ глобального перекрестного связывания белков в модели клеток Flo-1, реагирующей на интерферон.Экстракция триптических пептидов из несшитых и сшитых клеток позволяет проводить подсчет пептидов, обогащение путей и распределение длин пептидов с определенной интенсивностью LFQ.Канонические интерферон-индуцируемые белки были идентифицированы как положительный внутренний контроль, в то время как наблюдались новые межмолекулярные и внутримолекулярные сшитые аддукты канонических интерферон-индуцируемых белков, таких как MX1, UP18, OAS3 и STAT1.Исследованы различные особенности строения и взаимодействия в функциональных областях.
Взаимодействие между HLA-A, MDN1 и H2B было обнаружено с помощью иммуноблоттинга в клетках Flo-1 и A549, обработанных и необработанных IFNα.Наши результаты показывают, что комплексы HLA-A с H2B зависят от IFNα.Наша работа представляет собой интересное направление для дальнейшего изучения совместной локализации этих двух комплексов.Было бы также интересно расширить подход CLMS на панель клеточных линий для выявления независимых от типа клеток белковых взаимодействий, опосредованных интерфероном.Наконец, мы использовали MD-моделирование в качестве альтернативного подхода для понимания конформационной динамики белков, участвующих в комплексе H2BFS-HLA-A-HMGA1, который отслеживает внутримолекулярные и межмолекулярные перекрестные помехи.Выводы из данных CLMS позволяют предположить возможность различных конформаций белков H2BFS, HLA-A и HMGA1.Возможные различные конформации между этими комплексами стыковочных белков выявили несколько взаимодействий, аналогичных тем, которые наблюдаются в наборе данных CLMS.Одной из основных сильных сторон нашего метода является то, что он позволяет легко идентифицировать взаимодействующие высокополиморфные гены, такие как HLA, поэтому будет интересно изучить взаимодействия белков, специфичных для гаплотипа HLA, которые иначе трудно изучить.В совокупности наши данные демонстрируют, что CLMS может использоваться для расширения нашего понимания интерферон-индуцированных сигнальных сетей и обеспечения основы для изучения более сложных межклеточных систем в микроокружении опухоли.
Клетки Flo-1 получали из ATCC и хранили в DMEM (Gibco) с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (Invitrogen), 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco) и хранили при 37°C и 5% CO2.Инкубация.Клетки выращивали до 70-80% слияния перед обработкой IFNα14 (производства Edinburgh Protein Production Facility).Все остальные химикаты и реагенты были приобретены у Sigma Aldrich, если не указано иное.
Клетки Flo-1 культивировали в 6-луночных планшетах и ​​на следующий день клетки обрабатывали 10 нг/мл IFNα14 в течение 24 часов до приблизительно 80% слияния.Клетки трижды промывали PBS и лигировали со свежеприготовленным DSS (Thermo Fisher Scientific) (растворенным в ДМСО) в PBS в течение 5 минут при 37°С до конечной концентрации 0,5 мМ.Реакцию сшивания DSS заменяли PBS, а остаточный DSS гасили добавлением 20 мМ Трис (рН 8,0) в PBS в течение 15 минут при 37°C.Клетки собирали соскабливанием и собирали в пробирки с низким связыванием (Axygen).
Осадок клеток лизировали 300 мкл буфера для лизиса мочевины (8 М мочевина, 0,1 М Трис, pH 8,5) в течение 30 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая.Все этапы центрифугирования выполняли при 14 000 g при 8°C.Центрифугируйте лизат в течение 10 минут и перенесите супернатант в новую пробирку.Оставшиеся прозрачные частицы растворяли в 150 мкл второго лизирующего буфера (2 М мочевины, 2% (мас./об.) ДСН (додецилсульфат натрия)) в течение 30 минут или более до получения гомогенного водного раствора.Лизат центрифугировали в течение 20 минут и супернатант смешивали с лизатом, полученным на предыдущем этапе.Концентрации белка оценивали с помощью анализа Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя для процедур на микропланшетах.Образцы быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.
Примерно 100 мкг растворимого сшитого белка обрабатывали с использованием модифицированного протокола подготовки проб фильтрацией (FASP), как описано Wisniewski et al.69 Вкратце, белок сшивают с помощью 200 мкл мочевинного буфера (8 М мочевины в 0,1 М трис, pH 8,5), перемешивают и делят пополам.Все этапы центрифугирования выполняли при 14 000 g при 25°C.Первую половину лизата поперечно-сшитого белка переносили в центробежное фильтрующее устройство Microcon 10 кДа, оснащенное мембраной Ultracel-10 (Merck), с последующим центрифугированием на фильтре в течение 25 минут.Затем добавьте в фильтр вторую половину белка и повторите те же действия.Восстановление белка осуществляли добавлением 100 мкл 17 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорида (TCEP) в мочевинном буфере.Восстановленный материал перемешивали на термомиксере при 600 об/мин в течение 30 мин при 37°С.Кроме того, колонку центрифугировали и восстановленный сшитый белок алкилировали, используя 100 мкл 50 мМ йодацетамида в буфере мочевины.Реакцию алкилирования проводили при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте.Поверните колонку, промойте стенки колонки 3 раза 100 мкл буфера мочевины, а затем центрифугируйте.Ту же операцию проводили 3 раза, используя 100 мкл 100 мМ бикарбоната аммония.Перед трипсинизацией замените пробирку для сбора жидкости новой.Добавьте буфер для пищеварения, содержащий 50 мМ бикарбоната аммония и 1 мкл трипсина, разведенного в трипсиновом буфере (Promega).Соотношение трипсина к белку поддерживали на уровне примерно 1:33, а реакции переваривания инкубировали в течение ночи при 37°С во влажной камере.Сшитый пептид элюировали из фильтра центрифугированием в течение 25 минут.Извлечение пептидов улучшалось добавлением в фильтр 50 мкл 0,5 М NaCl с последующим центрифугированием в течение 25 минут.
Колонки C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) использовали для обессоливания сшитых триптических пептидов в соответствии с протоколом, описанным Bouchal et al.70 с небольшими модификациями.Вкратце, спин-колонки C18 активировали тремя промывками 0,1% муравьиной кислоты (FA) в ацетонитриле (AcN) (Merck) и двумя промывками 0,1% FA.Колонку гидратировали 0,1% FA в течение 15 минут.Загрузите образцы в центрифужные колонки и промойте 3 раза 0,1% FA.Обессоленные пептиды последовательно элюировали ступенчатым градиентом с использованием 50%, 80% и 100% AcN в 0,1% FA.Образцы сушили в концентраторе SpeedVac Plus (Eppendorf) до полного исчезновения остатков жидкости.Элюированные пептиды растворяли в 100 мкл 0,08% трифторуксусной кислоты в 2,5% AcN и концентрации измеряли с помощью NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Приблизительно 1 мкг сшитого пептида на образец вводили в систему ЖХ-МС/МС.
Сшитые пептиды разделяли на системе UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific), соединенной с масс-спектрометром Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Сшитые пептиды собирали на колонке для захвата C18 с внутренним диаметром 300 мкм и длиной 5 мм, заполненной сорбентом C18 PepMap100 и сорбентом PepMap 5 мкм (Thermo Scientific).Загрузите поток насоса, установленный на уровне 5 мкл/мин, 0,08% трифторуксусной кислоты, растворенной в 2,5% AcN.Сшитые пептиды разделяли на аналитической колонке из кварцевого стекла с внутренним диаметром 75 мкм и длиной 150 мм, заполненной сорбентом PepMap 2 мкм (Thermo Scientific).Подвижные фазы А и Б состояли из 0,1% ЖК в воде и 0,1% ЖК в ацетонитриле соответственно.Градиент начинается с 2,5% B и линейно увеличивается до 40% B в течение 90 минут, а затем до 90% B в течение следующих 2 минут.Состав подвижной фазы поддерживался на уровне 90% B в течение 10 минут, а затем линейно уменьшался до 2,5% B в течение 2 минут.Колонку уравновешивали 2,5% B в течение 8 минут перед следующим циклом.Сшитые пептиды, элюированные из аналитической колонки, ионизировали в источнике ионизации наноэлектроспреем (NSI) и вводили в масс-спектрометр Exploris 480 (Thermo Scientific).
Масс-спектрометр Orbitrap Exploris 480 работал в режиме положительной корреляции данных.Полное сканирование выполнялось в секционном режиме при разрешении 120 000 с настройками диапазона от m/z 350 Th до m/z 2000 Th.Нормализованное целевое значение АРУ было установлено на уровне 300% с максимальным временем ввода 50 мс.Для пептидов установлено обнаружение моноизотопных пиков.Параметр релаксации ограничений устанавливается в значение true, если обнаружено слишком мало предшественников.Минимальная ионная сила прекурсора была установлена ​​равной 5,0e3, а зарядовые состояния прекурсора до +8 были включены в эксперименты.
Время цикла между основными сканированиями в режиме корреляции данных было установлено равным 2,5 секунды.Динамическое исключение массы было установлено на 20 с после первой фрагментации иона-предшественника.Окно выделения предшественников было установлено на 2 Th.Тип нормализованной энергии столкновения с фиксированным режимом энергии столкновения был выбран при сканировании MS/MS, зависящем от данных.Энергия столкновения установлена ​​на 30%.Разрешение Orbitrap было установлено на 15 000, а целевое значение AGC — на 100%.Пользовательское максимальное время впрыска установлено на 60 миллисекунд.
Прежде чем отслеживать белок-белковую сеть в сшитых образцах, мы обработали необработанные файлы с помощью пакета MaxQuant (версия 1.6.12.0)26,27 для идентификации отслеживаемых пептидов/белков в образцах.Кроме того, аналогичные протеомные анализы были выполнены на несшитых образцах Flo-1, обработанных и необработанных IFNα.Данные МС/МС были найдены в базе данных человека UniProt (www.uniprot.org) (загружено 12 августа 2020 г., содержит 75 093 записи) с использованием встроенной поисковой системы Andromeda27.Поиск проводился без указания специфичности фермента и различных модификаций дезамидирования (N, Q) и окисления (М).Допуски по массе прекурсора были установлены на уровне 20 ppm, а дочерние ионы - на уровне 0,02 Да.Начальное и максимальное отклонение массы было установлено равным 10 ppm.Максимальная масса пептида была установлена ​​на уровне 4600 Да, а сходство последовательностей было установлено между 7 и 25 аминокислотами (аа).Дальнейший статистический анализ проводился с помощью программы Perseus (версия 1.6.10.45).Содержание белка рассчитывали путем нормализации спектральной интенсивности белка (интенсивность LFQ; немеченое количественное определение)27, а значения интенсивности конвертировали в Log2.Иерархическая кластеризация белков, идентифицированных по интенсивности их пептидов, была построена с использованием пакета pheatmap (v1.0.12) в R (v 4.1.2).Анализ обогащения путей проводился с использованием базы данных путей Reactome для белков, обработанных IFNα, которые были активированы более чем в четыре раза по сравнению с необработанными образцами.
Идентификацию химических сшивок, специфичных для лизина (K) или серина (S), в белковых комплексах, контролируемых методом ЖХ-МС/МС, проводили с использованием машины спектроскопической идентификации (SIM-XL) для сшитых пептидов (SIM-XL)29.Во-первых, возможные взаимодействия между генами сигнатуры устойчивости к повреждению ДНК (IRDS), ассоциированными с интерфероном (IFN), были исследованы с использованием набора данных по белкам IRDS, описанного Padariya et al.28.Скрининг всех состояний и повторов всего человеческого UniProt требует больших вычислительных ресурсов, поэтому вся база данных UniProt человека (www.uniprot.org) (загружена 12 августа 2020 г., содержит 75 093 записи) на предмет повторов, обработанных IFNα.Один из фильтров для высокодоверительных взаимодействий.Эти полученные высокозначимые взаимодействия были расширены и протестированы во всех повторениях и условиях.
В SIM-XL для сшивающего агента (XL) использовался DSS, а сдвиг веса XL и сдвиг веса модификации были установлены на 138,06 и 156,07 соответственно.Рассматриваются следующие сайты реакции сшивки: KK, KS и KN-TERM, без репортерных ионов.И предшественник, и фрагмент ppm были установлены на 20, а порог Xrea был установлен на 0,15.Трипсин считался полностью специфичным, и был реализован метод фрагментации высокоэнергетической C-ловушки (HCD).Порог динамического снижения DB XCorr и минимальное количество пептидов для динамического снижения DB были установлены на 2,5 и 2 соответственно.Другими параметрами являются: вероятность моноизотопа и порог совпадения пиков, минимум 4 остатка АК на цепь и максимальный заряд цепи, а также 3 максимума пропущенных расщеплений.Полученные сшитые 2D-карты были проанализированы в (SIM-XL), а для построения 2D-карт использовалось графическое представление xQuest28.Сшивки белков на белковых структурах предоставляются в PyMol (система молекулярной графики PyMOL, версия 2.0 Schrödinger, LLC).
Структуры белковых моделей были созданы с использованием сервера Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 с использованием принципов моделирования гомологии и реализации «Скрытого метода Маркова».Phyre2 генерирует модельные структуры на основе выравнивания последовательностей с известными белковыми структурами.Для белков H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 и MDN1 использовали матричные структуры 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 и 6i2665.Кроме того, была рассмотрена структура AlphaFold71 MX1, UBP18 и ROBO1.Структуру белка визуализировали с использованием пакета BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, Сан-Диего, Калифорния, США) и пакета Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада).