ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Дуплексная сварная трубка для химического компонента химической промышленности. Дефицит SPECC1L приводит к повышенной стабильности сращенных соединений и уменьшению отслаивания краниальных клеток нервного гребня.

Благодарим вас за посещение Nature.com.Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы показываем сайт без стилей и JavaScript.

АСТМ А790 2507/2205 1,4462/1,4410 трубка сваренная дуплексом для химической промышленности

Ляочэн Сихэ СС Материал Лтд.является ведущим производителем, специализирующимся на бесшовных трубах из нержавеющей стали, ярко отожженных трубах, бесшовных гибких трубах и т. д.Для удобства клиентов мы также свариваем трубы и трубки.Ляочэн Сихэ СС Материал Лтд.имеет самое современное производственное и испытательное оборудование.Мы можем полностью удовлетворить ваши требования.В соответствии со строгими стандартами, трубы, которые мы производим, всегда имеют правильные допуски по наружному диаметру и весу.Контроль допуска строго соответствует стандартам производства.Наша продукция всегда остается довольна клиентами.Клиенты, купившие нашу продукцию, получили больше прибыли.
а) Внешний диаметр (наружный диаметр): от 3,18 до 101,6 мм.
б) WT (толщина стенки): от 0,5 до 20 мм.
в) Длина: согласно требованию заказчика.
г) Стандарты: ASTM A312;АСТМ А269;АСТМ А789;АСТМ А790 и т. д.
д) Метод обработки: ERW, EFW и т. д.

Слайдеры, показывающие по три статьи на слайде.Используйте кнопки «Назад» и «Далее» для перемещения по слайдам или кнопки контроллера слайдов в конце для перемещения по каждому слайду.
Клетки краниального нервного гребня (CNCC) отслаиваются от эмбриональных нервных складок и мигрируют в глоточные дуги, которые образуют большую часть структур средней зоны лица.Дисфункция CNCC играет важную роль в этиологии орофациальной расщелины, распространенного врожденного порока развития.Гетерозиготные мутации SPECC1L были обнаружены у пациентов с атипичными и синдромальными расщелинами.Здесь мы сообщаем об усиленном окрашивании компонентов канонического адгезионного соединения (AJ), β-катенина и E-кадгерина в культивируемых нокдаун-клетках SPECC1L, а электронные микрофотографии показывают апикально-базальную диффузию AJ.Чтобы понять роль SPECC1L в краниофациальном морфогенезе, мы создали модель мыши с дефицитом Specc1l.Гомозиготные мутанты являются эмбрионально летальными и имеют нарушение закрытия нервной трубки и ламинирования CNCC.Окрашивание белка AJ увеличивается в мутантных нервных складках.Этот дефект AJ согласуется с дефектом расслоения CNCC, требующим растворения AJ.Кроме того, мутанты Specc11 снижают передачу сигналов PI3K-AKT и повышают апоптоз.In vitro легкого ингибирования передачи сигналов PI3K-AKT в клетках дикого типа было достаточно, чтобы вызвать изменения AJ.Важно отметить, что изменения AJ, вызванные нокдауном SPECC1L, можно обратить вспять путем активации пути PI3K-AKT.В совокупности эти данные позволяют предположить, что SPECC1L, как новый регулятор передачи сигналов PI3K-AKT и биологии AJ, необходим для закрытия нервной трубки и стратификации CNCC.
Клетки краниального нервного гребня (CNCCs) локализуются в дорсальной нейроэктодерме и отделяются от нейроэпителия развивающихся нервных складок посредством процесса, включающего эпителиально-мезенхимальный переход (EMT)1,2,3.Премигрирующие эпителиальные CNCC разрушают межклеточные соединения и становятся мигрирующими мезенхимальными CNCC, которые заполняют первую и вторую глоточные дуги и образуют большую часть черепно-лицевого хряща.Таким образом, гены, которые регулируют функцию CNCC, часто нарушаются в этиологии черепно-лицевых врожденных аномалий, таких как орофациальные расщелины, которые чаще всего поражают 1/800 рождений только в США.Одна из врожденных деформаций8.
Расслоение CNCC совпадает с закрытием передней нервной трубки между 8,5 и 9,5 днями эмбрионального развития у мышей.Мутанты ряда генов, связанных с орофациальной расщелиной мыши, также демонстрируют некоторую форму дефекта нервной трубки, включая Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 и Pdgfrα12.Однако процессы закрытия нервной трубки и стратификации CNCC можно считать независимыми, т.к. мыши-мутанты Slotch (Pax3) обнаруживают дефекты закрытия нервной трубки без какого-либо влияния на стратификацию или миграцию CNCC 13,14.Дополнительные модели мышей с дефектами диссекции CNCC и закрытия нервной трубки помогут очертить общую молекулярную основу этих двух процессов.
Выделение CNCC из нейроэпителиальных клеток требует растворения адгезивных соединений (AJ), которые состоят из белковых комплексов, содержащих, среди прочего, E-кадгерин, β-катенин, α-E-катенин и α-актинин, связанные с актиновыми нитями 2 Исследования сверхэкспрессии E-кадгерина в нервных складках показали уменьшение или задержку расслоения CNCC.И наоборот, подавление E-кадгерина приводит к ранней стратификации15,16.Многие из факторов, которые опосредуют EMT во время стратификации CNCC, представляют собой факторы транскрипции (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) и белки ремоделирования внеклеточного матрикса (ECM), такие как матриксные металлопротеиназы (MMP), однако CNCC являются прямыми цитоскелетными регуляторами AJ. еще не известно.Известно, что путь PI3K-AKT противодействует уровням E-кадгерина, в основном благодаря исследованиям рака17.Недавние исследования показали, что потеря передачи сигналов PI3K-AKT на основе PDGFα у мышей приводит к черепно-лицевым аномалиям, включая расщелину неба и дефекты нервной трубки12.Однако связь между путем PI3K-AKT и стабильностью AJ при стратификации CNCC неясна.
Ранее мы идентифицировали SPECC1L как первый мутантный ген у двух людей с тяжелой расщелиной, простирающейся ото рта до глаза, известной как косая расщелина (ObFC) или расщелина Тессье IV18.Мутации SPECC1L были идентифицированы в двух семьях, принадлежащих к нескольким поколениям, с аутосомно-доминантным синдромом Опитца G/BBB (OMIM #145410), в котором у больных наблюдались гиперрасстояние и расщелина губы/неба19, а также в одной семье с синдромом превышения большеберцовой кости (OMIM #145420)20 .более половины случаев синдрома Опитца G/BBB являются Х-сцепленными (OMIM #300000) и вызваны мутациями в гене MID1, который кодирует белок 22 клеточного скелета, связанного с микротрубочками.Мы предполагаем, что SPECC1L, также белок, ассоциированный с микротрубочками и актиновым цитоскелетом, может опосредовать передачу сигналов, необходимую для ремоделирования актинового цитоскелета во время клеточной адгезии и миграции 18 .Благодаря исследованиям in vitro и in vivo мы теперь описываем SPECC1L как новый регулятор стабильности AJ посредством передачи сигналов PI3K-AKT.На клеточном уровне дефицит SPECC1L приводил к снижению уровня белка пан-АКТ и увеличению апикально-базальной дисперсии AJ, что устранялось химической активацией пути АКТ.In vivo у эмбрионов с дефицитом Specc11 наблюдается нарушение закрытия нервной трубки и уменьшение расслоения CNCC.Т.о., SPECC1L участвует в высокорегулируемой передаче сигналов на основе клеточной адгезии, необходимой для нормальной функции CNCC во время морфогенеза лица.
Чтобы охарактеризовать роль SPECC1L на клеточном уровне, мы использовали ранее описанную стабильную линию клеток остеосаркомы U2OS, дефицитную по SPECC1L18.Эти стабильные клетки U2OS с нокдауном SPECC1L (kd) имели умеренное (60–70%) снижение уровней транскриптов и белков SPECC1L, наряду с дефектами миграции и реорганизации актинового цитоскелета 18. Напротив, наблюдалось тяжелое временное снижение Было показано, что SPECC1L приводит к митотическим дефектам 23 .При дальнейшей характеристике мы обнаружили, что наши стабильные клетки SPECC1L-kd изменили морфологию при очень высокой степени слияния (рис. 1).Отдельные контрольные клетки и клетки kd при низком слиянии выглядели одинаково (рис. 1A,D).Через 24 часа после слияния контрольные клетки сохраняли кубовидную форму (рис. 1Б, Д), тогда как клетки SPECC1L-kd удлинялись (рис. 1В, Е).Степень этого изменения формы клеток была зафиксирована с помощью живых изображений контрольных клеток и клеток kd in vivo (фильм 1).Чтобы определить роль SPECC1L в сливающихся клетках, мы сначала исследовали его экспрессию.Мы обнаружили, что уровни белка SPECC1L увеличивались при слиянии (рис. 1G), тогда как уровни транскрипта SPECC1L не увеличивались (рис. 1H).Кроме того, по мере увеличения плотности клеток белок SPECC1L накапливался на межклеточных границах (рис. 2A-E), причем паттерн перекрывался с паттерном связанного с мембраной β-катенина (рис. 2A'-E').Учитывая ассоциацию SPECC1L с актиновым цитоскелетом 18,23, мы предположили, что SPECC1L взаимодействует с основанными на актине адгезивными соединениями (AJ).
(AF) Нокдаун-клетки SPECC1L (DF) удлиняются при высоком слиянии (F) по сравнению с контрольными клетками U2OS (AC).Здесь показаны три из шести временных точек (T1, T3, T6), которые мы выбрали для разных плотностей клеток.(G) Вестерн-блот-анализ, показывающий, что белок SPECC1L стабилизируется при высокой степени слияния по сравнению с низкой степенью слияния в контрольных клетках.Вестерн-блот SPECC1L показывает ожидаемую полосу 120 кДа и полосу с более высокой молекулярной массой, возможно, посттрансляционно модифицированную (*).Вестерн-блот-анализ проводили в одинаковых условиях для низкой и высокой конфлюэнтности.Изображения, показывающие SPECC1L при низком и высоком слиянии, были взяты из одного и того же блота.Тот же блот удаляли и повторно исследовали с помощью антитела к β-актину.(H) Количественный анализ RT-PCR не выявил существенных изменений в уровнях транскрипта SPECC1L.Столбики ошибок представляют собой SEM из четырех независимых экспериментов.
(AE) Мы выбрали шесть временных точек (T1-T6), представляющих диапазон плотностей клеток, для нормализации анализа формы клеток и изменений AJ в клетках U2OS с нокдауном SPECC1L (kd).Первые пять из этих временных точек включали одиночные клетки (T1), 50-70% слияние небольших кластеров клеток (T2), слияние без изменения формы клеток kd (T3), изменение формы клеток kd (T4) и 24-часовые изменения.в задней форме клеток kd (T5).Белок SPECC1L был преимущественно диспергирован в цитоплазме на Т1 (А), но его накопление наблюдалось на межклеточных границах в последующие моменты времени (Б–Д, стрелки).(FJ) β-катенин демонстрирует аналогичное накопление на межклеточных границах, связанных с комплексом AJ.(A'-E') SPECC1L и β-катенин демонстрируют перекрывающееся окрашивание на границах клеток при высокой плотности клеток (стрелки).(F'-J') В клетках SPECC1L-kd окрашивание β-катенина выглядит нормальным при низкой плотности клеток (F'-H'), но увеличивается при изменении формы клеток (I', J'; стрелки), что указывает на то, что AJ были изменены.Бары = 10 мкм.
Затем мы попытались определить влияние дефицита SPECC1L на AJ.Мы использовали несколько AJ-ассоциированных маркеров, включая канонические компоненты F-актин, миозин IIb, β-катенин и E-кадгерин24,25,26,27.Актиновые стрессовые волокна увеличиваются в клетках SPECC1L-kd, как описано ранее (Рис. 3A,B) 18 .Миозин IIb, связанный с актиновыми нитями, показал аналогичное увеличение клеток SPECC1L-kd in vitro (рис. 3C,D).AJ-ассоциированный β-катенин связывается с кадгерином на клеточной мембране, демонстрируя нормальный «сотовый» паттерн экспрессии в контрольных кубоцитах (рис. 3E,G).Интересно, что на плоских изображениях, полученных с помощью конфокальной микроскопии, окрашивание β-катенина (рис. 3E,F) и E-кадгерина (рис. 3G,H) на клеточной мембране конфлюэнтных клеток с дефицитом SPECC1L показало заметные образцы расширенного окрашивания.Это расширение связанного с AJ окрашивания β-катенина в клетках kd было наиболее выраженным при слиянии, но, по-видимому, предшествовало изменениям формы клеток (рис. 2F-J, F'-J').Чтобы определить физическую природу этого расширенного окрашивания AJ, мы исследовали границы клеток на апикально-базальной поверхности клеток SPECC1L-kd U2OS с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) (рис. 3I,J).В отличие от контрольных клеток (рис. 3I), которые имели отдельные области электронной плотности, указывающие на AJ (стрелки), клетки kd (рис. 3J) демонстрировали большие, смежные области с высокой электронной плотностью, указывающие на AJ, вдоль апикобазальной плоскости..Кроме того, на поперечных срезах мы наблюдали обширные складки клеточной мембраны в клетках kd (рис. S1A,B), что объясняет расширенный характер полос окрашивания β-катенина и E-кадгерина (рис. 3F,H).В подтверждение роли SPECC1L в AJs β-катенин был коиммунопреципитирован с SPECC1L в лизатах конфлюэнтных клеток U2OS (рис. 3K).Наряду с расширенным иммуноокрашиванием на маркеры AJ, TEM-анализ соответствовал нашей гипотезе о том, что дефицит SPECC1L увеличивает апикально-базальную плотность и дисперсию AJ.
(AH) Повышенное окрашивание F-актина в клетках kd через 48 часов после слияния (T6; A, B).Измененное окрашивание миозина IIb, связанного с F-актином (C, D).Гладкая картина окрашивания мембран β-катенина и E-кадгерина в контрольных клетках (E, G) была усилена в клетках SPECC1L-kd (F, H).Бары = 10 мкм.(I – J) Электронные микрофотографии, наблюдающие за апикально-базальным межклеточным соединением.В контрольных клетках наблюдаются отчетливые электронно-плотные области, указывающие на липкие соединения (I, стрелки).Напротив, все апикально-базальное соединение в клетках SPECC1L-kd выглядело электронно-плотным (J, стрелки), что указывает на повышенную плотность и дисперсию адгезивных соединений.(K) β-катенин коиммунопреципитировали с SPECC1L в конфлюэнтных клеточных лизатах U2OS.Изображение сделано из одной точки и представляет собой один из четырех независимых экспериментов.
Чтобы понять роль SPECC1L в краниофациальном морфогенезе, мы создали модель мыши с дефицитом Specc1l, используя две независимые линии клеток-ловушек ES, DTM096 и RRH048 (BayGenomics, Калифорния), которые представляют интрон 1, а транскрипты Specc1l были захвачены в позиции 15 (рис. 1). .4А, рисунок С2).Геномное расположение вставки вектора-ловушки было определено путем полногеномного секвенирования и подтверждено ПЦР (рис. S2).Обе конструкции генных ловушек также позволяли слияние репортеров Specc11-lacZ в рамке после захвата.Поэтому экспрессию lacZ, определенную с помощью окрашивания X-gal, использовали в качестве индикатора экспрессии Specc11.Оба аллеля показали схожие паттерны экспрессии lacZ, при этом ловушка гена DTM096 в интроне 1 демонстрировала более сильную экспрессию, чем RRH048 в интроне 15 (не показано).Тем не менее, Specc1l широко экспрессируется, с особенно сильной экспрессией в нервных складках на E8.5 (рис. 4B), в нервной трубке и лицевых отростках на E9.5 и E10.5 (рис. 4C,D), а также в развивающихся конечностях. на Е10.5 и глаза (рис. 4D).Ранее мы сообщали, что экспрессия SPECC1L в первой глоточной дуге на E10.5 присутствует в эпителии и подлежащей мезенхиме18, что соответствует линии CNCC.Чтобы проверить экспрессию SPECC1L при CNCC, мы выполнили срезы нервных складок E8.5 (рис. 4E-J) и черепа E9.5 (рис. 4K-).На E8.5 SPECC1L интенсивно окрашивал нервные складки (рис. 4E, H), включая клетки, окрашенные маркерами NCC (рис. 4G, J).На E9.5 SPECC1L (рис. 4K, N) сильно окрашивал мигрирующий CNCC, окрашенный совместно с AP2A (рис. 4L, M) или SOX10 (рис. 4O, P).
(A) Схематическое изображение мышиного гена Specc11, показывающее вставку вектора-ловушки в клоны клеток ES DTM096 (интрон 1) и RRH048 (интрон 15).(BD) Окрашивание lacZ гетерозиготных эмбрионов Specc1lDTM096, отражающих экспрессию Specc1l от E8.5 до E10.5.NE = нейроэктодерма, NF = нервная складка, PA1 = первая глоточная дуга.(EP) Иммуноокрашивание SPECC1L с маркерами NCC AP2A и SOX10 в нервных складках E8.5 (NF; EJ) и срезах черепа E9.5 (KP).Окрашивание SPECC1L широко наблюдалось в нервных складках E8.5 (E, H; наконечники стрелок), включая клетки, меченные AP2A (F, G; наконечники стрелок) и SOX10 (I, J; наконечники стрелок).На E9.5 SPECC1L сильно окрашивал мигрирующие CNCC (K, N; стрелки), меченные AP2A (L, M; стрелки) и SOX10 (O, P; стрелки).
Скрещивание гетерозиготных мышей Specc1lDTM096/+ и Specc1lRRH048/+ показывает, что две аллели генных ловушек не являются комплементарными и что составные гетерозиготы и эмбриональные гомозиготы для любого аллеля генной ловушки являются эмбриональными летальными (таблица S1).Менделевские коэффициенты указывали на снижение выживаемости гетерозигот при рождении (ожидаемые 1,34 против 2,0).Мы отметили низкую перинатальную смертность среди гетерозигот, у некоторых были черепно-лицевые аномалии (рис. С3).Однако низкая пенетрантность этих перинатальных краниофациальных фенотипов затрудняет изучение лежащих в их основе патофизиологических механизмов.Поэтому мы сосредоточились на эмбриональном летальном фенотипе гомозиготных мутантов Specc11.
Большинство сложных гетерозиготных или гомозиготных мутантных эмбрионов Specc1lDTM096/RRH048 не развивались после E9.5–10.5 (рис. 5A–D), а нервная трубка не закрывалась спереди (рис. 5B, D), а иногда закрывалась сзади (не показано). ..Этот краниальный дефект закрытия нервной трубки был связан с тем, что большая часть DLX2, отмеченного CNCC, оставалась в нервных складках на этапе E10.5, что указывает на отсутствие расслоения (рис. 5A'-D').Чтобы определить, уменьшился ли общий размер CNCC, мы пометили линии CNCC с помощью GFP в наших линиях генных ловушек с помощью Wnt1-Cre и ROSAmTmG.Мы получаем отсортированные GFP+ NCC и GFP- (RFP+) не-NCC из целых эмбрионов.На E9.5 доля CNCC, меченных GFP с проточной сортировкой, существенно не менялась между дикими и мутантными эмбрионами (не показано), что указывает на нормальную спецификацию CNCC.Таким образом, мы предположили, что остаточное окрашивание Wnt1-Cre и DLX2 в обнаженных нервных складках (рис. 5B') происходит из-за дефектного наслоения CNCC, возможно, из-за повышенной плотности или дисперсии клеток AJ, как это видно в клетках SPECC1L-kd.Мы использовали маркеры NCC SOX10, AP2A и DLX2, чтобы подтвердить наличие CNCC в нервной складке (рис. 5E-R).На E8.5 окрашивание нервных складок для всех трех маркеров NCC наблюдалось в срезах WT (рис. 5E, G, I) и мутанта Specc1l (рис. 5F, H, J).На E9.5, в то время как маркеры NCC окрашивали мигрирующие NCC в срезах WT (рис. 5M, O, Q), остаточное окрашивание NCC наблюдалось в обнаженных нервных складках мутантных эмбрионов Specc1l (рис. 5N, P, R).Поскольку SOX10 и DLX2 маркируют мигрирующие CNCC, этот результат предполагает, что SPECC1L-дефицитные CNCC достигают постмиграционной спецификации, но не могут мигрировать из нервных складок.
Дефицит Specc11 приводит к нарушению закрытия нервной трубки, отслоению краниальных клеток нервного гребня и AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Эмбрион, несущий мигрирующие краниальные клетки нервного гребня (CNCC), меченные Wnt1-Cre (A').Напротив, мутантные эмбрионы Specc11 демонстрируют открытые нервные складки (B), наконечники стрелок) и CNCC, которые не мигрировали (B', наконечники стрелок).(C, D') Светлопольные изображения (C, D') и иммуноокрашивание (C', D') маркера CNCC DLX2 эмбрионов E10.5 WT (C, C') и Specc1l (D, D').У эмбрионов WT E10.5 DLX2-положительные CNCC колонизируют жаберные дуги (C', стрелки), тогда как у мутантов заметное окрашивание сохраняется в открытых нервных складках (D', стрелки) и в первых глоточных дугах (D', стрелки).) с некоторым окрашиванием (стрелки), указывающим на плохое расслоение и миграцию CNCC.ER) Срезы мутантных эмбрионов WT и Specc1l на стадиях E8.5 (E-L) и E9.5 (M-R) были помечены маркерами NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, О, P) и DLX2 (I, J, Q, R).На E8.5 окрашивание NCC наблюдалось в нервных складках дикого типа (NF) и мутантных секциях.Совместное окрашивание SOX10 и β-катенина у E8.5 WT (K) и мутанта (L) выявило повышенное окрашивание β-катенина на границах клеток в нервных складках.На E9.5 наблюдалось окрашивание мигрирующих CNCC дикого типа (M, O, Q), тогда как у мутантов нестратифицированные CNCC окрашивали открытые нервные складки (N, P, R).(S – Z) Анализ маркировки AJ in vivo в корональных срезах эмбрионов WT и Specc11DTM096/RRH048 с мутацией E9.5.Примерная плоскость сечения показана в правом верхнем углу.В срезах мутантных тканей наблюдалось повышенное окрашивание F-актина (S, Т) и миозина IIb (U, V).Подобно результатам in vitro, представленным на рис. 3, у мутантных эмбрионов наблюдалось усиленное окрашивание мембран на β-катенин (W, X) и E-кадгерин (Y, Z).(AA-BB) Электронная микрофотография среза эмбриона дикого типа, выходящего за границу апикально-базальной клетки, показывает отчетливую электронно-плотную область, указывающую на адгезионные соединения (AA, стрелки).Напротив, в срезах мутантных эмбрионов Specc11 (BB, стрелки) все апикобазальное соединение является электронно-плотным, что указывает на повышенную плотность и дисперсию адгезивных соединений.
Чтобы проверить нашу гипотезу о том, что снижение наслоения происходит из-за измененного AJ, мы исследовали маркировку AJ в обнаженных нервных складках мутантных эмбрионов Specc1l (Рис. 5S-Z).Мы наблюдали увеличение количества актиновых стрессовых волокон (рис. 5S, T) и сопутствующее усиление локализации окрашивания миозина IIB на актиновых волокнах (рис. 5U, V).Важно отметить, что мы наблюдали повышенное окрашивание β-катенина (рис. 5W,X) и E-кадгерина (рис. 5Y,Z) на межклеточных границах.Мы также исследовали окрашивание β-катенина NCC в нервных складках эмбрионов E8.5 (рис. 5K, L).Окрашивание β-catenin оказалось более сильным в мутантных нервных складках Specc1l (рис. 5L и K), указывая на то, что изменения AJ начались.На электронных микрофотографиях срезов черепа эмбрионов E9.5 мы снова наблюдали повышенное диффузное электронно-плотное окрашивание у мутантных эмбрионов Specc1l по сравнению с WT (рис. 5AA, BB и S1E-H).В совокупности эти результаты подтверждают наши результаты in vitro в клетках SPECC1L-kd U2OS и позволяют предположить, что аберрантное окрашивание AJ предшествует стратификации CNCC в наших мутантных эмбрионах.
Учитывая известную антагонистическую взаимосвязь между активностью AKT и стабильностью E-кадгерина,17,28 мы предположили участие передачи сигналов PI3K-AKT.Кроме того, мы наблюдали субэпидермальные волдыри у некоторых наших мутантных эмбрионов, которые избежали летальности (<5%) на этапе E9.5-10.5 и вместо этого обосновались примерно на этапе E13.5 (рис. S3).Субэпидермальные везикулы являются признаком сниженной передачи сигналов PI3K-AKT на основе PDGFRα12.Фантауццо и др.(2014) сообщили, что нарушение активации PI3K на основе PDGFRα у мутантных эмбрионов PdgfraPI3K/PI3K приводит к субэпидермальным везикулам, дефектам нервной трубки и фенотипам расщелины неба.Действительно, уровни пан-АКТ и активного фосфорилированного Ser473-AKT были снижены in vivo в мутантных тканях Specc1l до остановки эмбриона E9.5 (рис. 6A-D).Снижение уровней фосфорилированного Ser473-AKT может быть полностью обусловлено снижением уровней пан-AKT in vivo (фиг. 6E) и in vitro (фиг. 6F).Снижение in vitro наблюдалось только тогда, когда клетки U2OS сильно сливались с изменениями формы клеток и плотности AJ (рис. 6D).Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что SPECC1L является новым положительным регулятором передачи сигналов PI3K-AKT в краниофациальном морфогенезе.
(A–E) Срезы черепа E8.5 (A,B) и E9.5 (C,D) или лизаты E9.5 из мутантных эмбрионов Specc1l (E), показывающие уровни активного фосфорилированного S473-AKT и снижения пан-AKT белка. , по сравнению с контрольным WT.Вестерн-блоттинг проводили на лизатах дикого типа и мутантных лизатах в одинаковых условиях.Изображения, показанные для SPECC1L, были взяты из одного блота.Тот же блот удаляли и повторно исследовали с использованием антител против пан-ACT и β-актина.Уровни Pan-AKT в нервных складках E8.5 (A, B) и уровни фосфорилированного S473-AKT в секциях черепа E9.5 были значительно снижены.(F) Уровни Pan-AKT были аналогичным образом снижены в лизатах клеток SPECC1L-kd U2OS, собранных при высокой степени слияния.Столбики ошибок представляют собой SEM из трех независимых количественных вестерн-блоттингов.(GJ) Срезы эмбрионов дикого типа на уровне E9.5, окрашенные KI67 и расщепленной каспазой 3 соответственно, демонстрирующие пролиферацию клеток (G, G') и небольшую апоптотическую активность (H, H').Мутантные эмбрионы Specc11 демонстрируют сопоставимую пролиферацию клеток (I), но количество клеток, подвергающихся апоптозу, значительно увеличивается (J).
Затем мы исследовали маркеры пролиферации и апоптоза.Мы не наблюдали никакой разницы в пролиферации эмбрионов E9.5 (рис. 6E, G по сравнению с I) с индексом пролиферации 82,5% для мутантов WT и 86,5% для мутантов Specc1l, измеренным с помощью окрашивания KI67 (p <0,56, Фишера). точный тест).Аналогичным образом, мы не наблюдали каких-либо различий в апоптозе, измеренном путем окрашивания расщепленной каспазы 3 в нервных складках на этапе E8.5 до остановки эмбриона (не показано) (не показано).Напротив, апоптоз был значительно увеличен у всех мутантных эмбрионов E9.5 (рис. 6F, H и J).Это общее увеличение апоптоза согласуется со снижением передачи сигналов PI3K-AKT и ранней эмбриональной смертностью29,30,31.
Затем, чтобы подтвердить причинную роль передачи сигналов PI3K-AKT в изменениях AJ в наших клетках kd, мы химически изменили путь в контрольных клетках и клетках kd (рис. 7A-F).В качестве маркера мы использовали фенотип изменения формы клеток, наблюдаемый в конфлюэнтных клетках SPECC1L-kd, который мы количественно оценили, используя отношение самого длинного размера (длины) к соответствующему вертикальному размеру (ширине).Соотношение 1 ожидается для относительно круглых или кубовидных клеток (рис. 7G).Помимо формы клеток, мы также подтвердили влияние на AJ окрашиванием β-катенина (рис. 7A'-F').Ингибирование пути PI3K-AKT с помощью вортманнина было достаточным для изменения формы клеток в контрольных клетках (рис. 7A,C) и AJ (рис. 7A').Активатор PI3K-AKT SC-79 не влиял на форму клеток (фиг. 7А, Е) или расширение AJ (фиг. 7А') в контрольных клетках.В клетках SPECC1L-kd дальнейшее подавление пути PI3K-AKT приводило к усилению апоптоза (рис. 7B,D) и заметному увеличению окрашивания β-катенина (рис. 7B'), что согласуется с нашими тяжелыми мутантами in vivo.Важно отметить, что активация пути PI3K-AKT значительно улучшила форму клеток (рис. 7B,F) и фенотипы AJ (рис. 7B»).Изменения в форме клеток количественно оценивали как коэффициент округлости клеток (CCR) и сравнивали по значимости, как описано выше (фиг. 7G).Действительно, в контрольных клетках (рис. 7G, CCR = 1,56) обработки вортманнином было достаточно, чтобы значительно изменить форму клеток (рис. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) до степени, сходной с наблюдаемой. в SPECC1L.-kd клетки (рис. 7Г, CCR = 3,46).Обработка вортманнином клеток SPECC1L-kd (рис. 7G, CCR = 3,60, незначительная) была не более значимой, чем необработанные клетки kd (рис. 7G, CCR = 3,46, незначительная) или обработанные вортманнином контрольные клетки (рис. 7G)., CCR = 3,46, незначительно) дополнительно влияет на удлинение клеток (7G, CCR = 3,61, незначительно).Самое главное, что активатор SC-79 AKT восстановил удлиненный фенотип клеток SPECC1L-kd (рис. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Эти результаты подтверждают, что SPECC1L регулирует передачу сигналов PI3K-AKT, и позволяют предположить, что умеренное снижение SPECC1L влияет на клеточную адгезию, тогда как сильное снижение приводит к апоптозу (рис. 8).
(A–F') Контрольные (A, C, E) и клетки SPECC1L-kd (B, D, F), обработанные ингибитором пути PI3K-AKT вортманнином (C, D) или активатором SC-79 (E, F) Лечение .Необработанные контрольные клетки имеют кубическую форму (А) с нормальным окрашиванием клеток β-cat (A'), тогда как клетки kd имеют удлиненную форму (B) с повышенным окрашиванием клеток β-cat (B').После подавления пути PI3K-AKT контрольные клетки удлинились (C) с экспансией β-cat (C'), в то время как клетки kd начали подвергаться апоптозу (D), подобно нашим сильно мутировавшим эмбрионам и демонстрирующим чрезвычайно усиленный β-cat.окрашивание (D').После активации пути PI3K-AKT контрольные клетки оставались кубовидными (E) и имели нормальное окрашивание β-cat (E'), в то время как клетки kd демонстрировали значительно улучшенную форму клеток (F) и окрашивание β-cat (F'), что указывает на (G) Степень изменения формы клеток в (AF) определяли количественно с использованием коэффициента округлости клеток (CCR) самого длинного размера (длины) и соответствующего вертикального размера (ширины) с использованием программного обеспечения MetaMorph.Необработанные (NT) клетки SPECC1L-kd (CCR = 3,46) были значительно длиннее, чем контрольные клетки (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Ингибирование Вортом пути PI3K-AKT в контрольных клетках было достаточным, чтобы вызвать аналогичное удлинение формы клеток (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Аналогично, активация AKT с помощью SC-79 в клетках SPECC1L-kd восстанавливала удлинение клеток до контрольных уровней (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).Обработка вортманнином клеток SPECC1L-kd приводила к усилению апоптоза, но не к дальнейшему увеличению изменения формы клеток (CCR=3,60) по сравнению с необработанными kd (CCR=3,46, нс) или обработанными вортманнином контрольными клетками (3,61), наблюдаемыми в .нс = не имеет значения.Показаны измерения +/- СЭМ для 50 ячеек.Статистические различия рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента.
(A) Схематическое изображение ингибирования и активации пути PI3K-AKT, приводящего к изменениям и спасению AJ соответственно.(B) Предлагаемая модель стабилизации белка AKT с помощью SPECC1L.
Премиграционные CNCC требуют лизиса AJ для отделения от нейроэпителиальных клеток передней нервной складки1,15,32.Повышенное окрашивание компонентов AJ и потеря апикально-базального асимметричного распределения AJ в клетках с дефицитом SPECC1L как in vitro, так и in vivo, в сочетании с физической близостью SPECC1L к β-катенину, позволяют предположить, что SPECC1L функционирует, чтобы правильно поддерживать локальную стабильность AJ для организация мышц.актиновый цитоскелет.Ассоциация SPECC1L с актиновым цитоскелетом и β-катенином и увеличение количества конденсированных актиновых филаментов в отсутствие SPECC1L согласуются с наблюдаемым увеличением плотности AJ.Другая возможность состоит в том, что увеличение количества актиновых волокон в клетках с дефицитом SPECC1L приводит к изменению межклеточного натяжения.Поскольку клеточный стресс влияет на динамику AJ 33, изменения напряжения могут привести к более диффузному AJ 34 .Поэтому любые изменения повлияют на слои CNCC.
Wnt1 экспрессируется в ранних нервных складках, которые дают начало клеткам нервного гребня.Т.о., отслеживание линии Wnt1-cre маркирует как пре-, так и мигрирующий NCC35.Однако Wnt1 также маркирует клоны дорсальной ткани головного мозга, также происходящие из ранних нервных складок 35,36 , что делает вероятным, что наше окрашивание мутантов E9.5 на маркеры Wnt1 в открытых нервных складках не является CNCC.Наше положительное окрашивание на маркеры NCC AP2A и SOX10 подтвердило, что обнаженные нервные складки мутантных эмбрионов Specc11 действительно содержали CNCC.Кроме того, поскольку AP2A и SOX10 являются маркерами рано мигрирующих NCC, положительное окрашивание указывало на то, что эти клетки представляют собой постмиграционные CNCC, которые не могут быть стратифицированы с помощью E9.5.
Наши данные показывают, что молекулярная регуляция AJ с помощью SPECC1L опосредована передачей сигналов PI3K-AKT.Передача сигналов AKT снижается в клетках и тканях с дефицитом SPECC1L.Результаты Fantauzzo et al.подтверждают прямую роль передачи сигналов PI3K-AKT в краниофациальном морфогенезе.(2014) показали, что отсутствие активации передачи сигналов PI3K-AKT на основе PDGFRα приводит к фенотипу расщелины неба.Мы также показываем, что ингибирования пути PI3K-AKT достаточно для изменения AJ и формы клеток в клетках U2OS.В соответствии с нашими выводами, Cain et al.37 показали, что подавление субъединицы PI3K α110 в эндотелиальных клетках приводит к аналогичному увеличению перицеллюлярного окрашивания β-катенина, называемому увеличением «индекса связности».Однако в эндотелиальных клетках, чьи актиновые нити уже высокоорганизованы, подавление пути PI3K-AKT приводит к рыхлой форме клеток.Напротив, клетки SPECC1L-kd U2OS имели удлиненную форму.Эта разница может быть специфичной для типа клеток.Хотя подавление передачи сигналов PI3K-AKT постоянно влияет на актиновый цитоскелет, влияние на форму клеток определяется изменениями напряжения, вызванными изменениями плотности и организации центральных актиновых волокон.В клетках U2OS мы использовали только изменения формы клеток в качестве маркера изменения и восстановления AJ с дефицитом SPECC1L.В заключение мы предполагаем, что ингибирование пути AKT при дефиците SPECC1L увеличивает стабильность AJ и уменьшает расслоение в CNCC.
Интересно, что уровни пан-АКТ были снижены in vitro и in vivo в дополнение к уровням фосфорилированного 473-АКТ в отсутствие SPECC1L, что позволяет предположить регуляцию передачи сигналов PI3K-AKT на уровне стабильности или оборота белка AKT.Гены SPECC1L и MID1, оба ассоциированные с синдромом Opitz/GBBB, кодируют белки, которые стабилизируют микротрубочки 18,22 .Механизм, с помощью которого SPECC1L и MID1 обеспечивают стабилизацию микротрубочек, до конца не изучен.В случае SPECC1L эта стабилизация включает усиление ацетилирования субнабора микротрубочек 18 .Вполне возможно, что SPECC1L использует аналогичный механизм для стабилизации других белков, таких как AKT.Показано, что ацетилирование остатков лизина в белке АКТ приводит к снижению мембранной локализации и фосфорилирования38.Кроме того, убиквитинирование цепи K63 по тому же остатку лизина на АКТ необходимо для ее мембранной локализации и активации39,40.Среди нескольких факторов, взаимодействующих с белками SPECC1L, выявленных в различных высокопроизводительных двухгибридных скринингах дрожжей, четыре - CCDC841, ECM2942, APC и UBE2I43 - участвуют в обороте или стабильности белка посредством убиквитинирования или сумойилирования.SPECC1L может участвовать в посттрансляционной модификации остатков лизина AKT, влияя на стабильность AKT.Однако решающая роль SPECC1L в локализации и стабильности белка AKT еще предстоит выяснить.
Серьезные дефекты экспрессии SPECC1L in vivo приводили к усилению окрашивания маркера AJ и дефектному наложению CNCC, а также к усилению апоптоза и ранней эмбриональной смертности.Предыдущие сообщения показали, что мутанты мышей с повышенным уровнем апоптоза связаны с дефектами нервной трубки 44,45,46,47 и черепно-лицевыми дефектами48.Было высказано предположение, что чрезмерная гибель клеток в нервных складках или глоточных дугах может приводить к недостаточному количеству клеток, необходимых для правильного морфогенетического движения 48,49,50.Напротив, наши клеточные линии с дефицитом SPECC1L и умеренно сниженной экспрессией SPECC1L показали только изменения AJ без признаков повышенной гибели клеток.Однако химическое ингибирование пути PI3K-AKT в этих клетках Kd действительно приводило к усилению апоптоза.Таким образом, умеренное снижение экспрессии или функции SPECC1L обеспечивает выживание клеток.Это согласуется с наблюдением, что редкие эмбрионы с мутацией Specc11, избежавшие ареста на ст.E9.5 — возможно, из-за снижения эффективности захвата генов — способны закрывать свои нервные трубки и останавливаться на более позднем этапе развития, часто с черепно-лицевыми дефектами (рис. S3).Этому также соответствует редкая встречаемость гетерозиготных эмбрионов Specc1l с черепно-лицевыми аномалиями (вероятно, из-за повышенной эффективности захвата генов), а также обнаружение у рыбок данио, у которых один из двух ортологов SPECC1L (specc1lb) вызывает поздние эмбриональные фенотипы, включая потерю нижние челюсти и двусторонние расщелины51.Т.о., гетерозиготные мутации потери функции SPECC1L, выявленные у пациентов-людей, могут вызывать небольшие нарушения функции SPECC1L во время краниофациального морфогенеза, достаточные для объяснения их орофациальных расщелин.Регуляция межклеточных контактов на основе SPECC1L может также играть роль в палатогенезе и слиянии глоточных дуг.Дальнейшие исследования функции SPECC1L помогут выяснить роль временных межклеточных контактов при CNCC во время закрытия нервной трубки в подвижности нейроэпителиальных клеток и краниофациальном морфогенезе.
Контроль остеосаркомы U2OS и клетки SPECC1L-kd были описаны ранее (Saadi et al., 2011).Антитела против SPECC1L также были охарактеризованы ранее (Saadi et al., 2011).Антитела против β-катенина (кролик; 1:1000; Санта-Круз, Даллас, Техас) (мышь; 1:1000; Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс), миозин IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, Сент-Луис) ) , Миссури)), E-кадгерин (1:1000; Abkam, Кембридж, Массачусетс), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Литтлтон, Колорадо), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, Сан-Диего) , Калифорния), DLX2 (1:1000; Abcam, Кембридж, Массачусетс), фосфо-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс), пан-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс), расщепленная каспаза 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс) и β-актин (1:2500; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МО) использовали, как описано..Актиновые нити окрашивали родамином фаллоидином Acti-stain (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Контрольные клетки U2OS и клетки SPECC1L-kd культивировали в стандартной среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния).Для определения изменений AJ 2×105 клеток высевали на стекло, обработанное 0,1% свиного желатина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), и наблюдали за изменениями формы клеток.Клетки собирали в разные указанные моменты времени: через 4 часа после посева (t=1), через 24 часа после посева (t=2), слияние без изменения формы клеток (t=3), изменение формы клеток (t=4). , через 24 ч после изменения формы клеток (t = 5) и через 48 ч после изменения формы клеток (t = 6) (рис. 1, 2, 3).Для модуляции пути PI3K-AKT клетки культивировали в указанных концентрациях с ингибитором PI3K-AKT вортманнином (TOCRIS Biosciences, Миннеаполис, Миннесота) или активатором SC-79 (TOCRIS Biosciences, Миннеаполис Адамс, Миннесота).Среду, содержащую химикаты, меняли ежедневно.
Покадровую запись проводили на живых контрольных клетках и клетках KD в нормальных условиях культивирования, а фазово-контрастные изображения собирали каждые 10 минут в течение 7 дней.Изображения были получены с помощью инвертированного микроскопа Leica DM IRB с компьютерным управлением, оснащенного механическим столиком и объективом 10 × N-PLAN, подключенным к камере QImaging Retiga-SRV.Во время визуализации клеточные культуры поддерживали при температуре 37°C во влажной атмосфере с 5% CO2.
Две линии ES-клеток с генной ловушкой DTM096 и RRH048 из Регионального центра ресурсов мутантных мышей (Калифорнийский университет в Дэвисе, Калифорния) использовали для создания линий мышей с дефицитом Specc11, обозначенных Specc1lgtDTM096 и Specc1lgtRRH046.Вкратце, ES-клетки 129/REJ инъецировали в бластоцисты C57BL6.Полученных химерных мышей-самцов скрестили с мышами-самками C57BL6 для идентификации потомства с окраской шерсти агути.Наличие вставок вектора-ловушки гена использовали для идентификации гетерозигот.Мышей содержали на смешанном фоне 129/REJ;C57BL6.Местоположение места вставки вектора генетической ловушки было подтверждено с помощью RT-PCR, секвенирования генома и генетической комплементации (дополнительный рисунок 1).Чтобы проследить линию CNCC двойных гетерозиготных мышей Specc1lGT, мышей ROSAmTmG (#007576) и Wnt1-Cre (#003829) (Лаборатория Джексона, Бар-Харбор, Мэн) скрещивали для получения аллели ROSAmTmG и Wnt1-Cre в мутантных эмбрионах Specc1l.Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с протоколами, одобренными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского центра Университета Канзаса.
Эмбрионы фиксировали в (1% формальдегид, 0,2% глутаральдегид, 2 мМ MgCl2, 0,02% NP-40, 5 мМ ЭГТА) в течение 60 мин при комнатной температуре.После фиксации в растворе для окрашивания X-gal (5 мМ феррицианид калия, 5 мМ ферроцианид калия, 2 мМ MgCl2, 0,01% дезоксихолат натрия, 0,02% NP-40, 1 мг/мл X-гал) Проявление окраски осуществляли при 37°C. .°С в течение 1-6 часов.Эмбрионы постфиксировали в 4% PFA и визуализировали.
Для вестерн-блоттинга клетки лизировали в буфере для пассивного лизиса (Promega, Fitchburg, WI), дополненном смесью ингибиторов протеазы HALT (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури).Лизаты обрабатывали на 12% полиакриламидных готовых гелях Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) и переносили на мембраны Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Мембраны блокировали в 5% молоке в PBS, содержащем 0,1% Твина.Антитела инкубировали в течение ночи при 4°С или в течение одного часа при комнатной температуре.Для генерации сигнала использовали реагент Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс).Для иммуноокрашивания эмбрионы фиксировали на ночь в 4% PFA/PBS и криоконсервировали.Криосрезы тканей блокировали в PBS, содержащем 1% нормальной козьей сыворотки (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс) и 0,1% тритона Х-100 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), а затем инкубировали при 4°C в инкубаторе в течение ночь.с анти-антителом и флуоресцентным вторичным антителом (1:1000) в течение 1 часа при 4°С.Окрашенные срезы помещали в золотую среду ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) и плоские изображения получали с использованием конфокального микроскопа Leica TCS SPE.Каждое иммуноокрашивание проводили как три независимых эксперимента по цироссекции как минимум двух мутантных эмбрионов.Показан репрезентативный эксперимент.
Клетки инкубировали в модифицированном буфере RIPA (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 мМ NaCl, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА и ингибитор протеазы HALT (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Вкратце, лизаты предварительно очищали с помощью магнитных шариков белка G (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), а затем инкубировали в течение ночи при 4°C с анти-SPECC1L или IgG. Белковые шарики белка G использовали для извлечения SPECC1L, и проводили вестерн-блоттинг с использованием анти-SPECC1L. Антитело к -β-катенину, описанное выше. Показанные эксперименты по со-IP являются репрезентативными для четырех независимых экспериментов.
Фиксированные культивированные клетки или эмбриональные ткани мыши были предоставлены в центр электронной микроскопии Медицинского центра Университета Канзаса.Вкратце, образцы заливали в смолу EMbed 812 (Electron Microscope Sciences, Форт Вашингтон, Пенсильвания), полимеризовали в течение ночи при 60°C и делали срезы при 80 нм с использованием ультрамикротома Leica UC7, оснащенного алмазным лезвием.Срезы визуализировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEOL JEM-1400, оснащенного пушкой Lab6 на 100 кВ.
Как цитировать эту статью: Wilson, NR et al.Дефицит SPECC1L приводит к повышению стабильности сращенных суставов и уменьшению расслоения краниальных клеток нервного гребня.наука.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Сен-Жанн, Ж.-П.Индукция и дифференцировка нервного гребня.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Кордеро, Д.Р. и др.Клетки краниального нервного гребня в движении: их роль в черепно-лицевом развитии.Американский журнал медицинской генетики.Часть A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Боланд, Р.П. Нейрокристопатия: ее рост и развитие за 20 лет.Педиатр.патология.лаборатория.лекарство.17, 1–25 (1997).
Мангольд Э., Людвиг К.Ю. и Нотен М.М. Прорыв в генетике орофациальных расщелин.Тенденции в молекулярной медицине 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Мину, М. и Райли, Ф.М. Молекулярные механизмы краниальной миграции клеток нервного гребня и формирования паттерна во время черепно-лицевого развития.Разработка 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Диксон М.Дж., Маразита М.Л., Бити Т.Х. и Мюррей Дж.К. Расщелина губы и неба: понимание генетических и экологических влияний.естественный комментарий.Генетика 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ингрэм, CR и др.Аномальный морфогенез кожи, конечностей и черепно-лицевой области у мышей с дефицитом интерферон-регулирующего фактора-6 (Irf6).Национальный Женетт.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Пейрар-Джанвид, М. и др.Доминантные мутации в GRHL3 вызывают синдром Ван дер Ворда и нарушают развитие перидермы полости рта.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Харрис, М.Дж. и Джурилофф, Д.М. Обновите список мышиных мутантов с дефектами закрытия нервной трубки и продвиньтесь к полному генетическому пониманию закрытия нервной трубки.Исследование врожденных дефектов.Часть A, Клиническая и молекулярная тератология 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Фантауццо К.А. и Сориано П. PI3K-опосредованная передача сигналов PDGFRalpha регулирует выживание и пролиферацию в развитии скелета посредством p53-зависимого внутриклеточного пути.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Копп, А.Дж., Грин, Н.Д. и Мердок, Дж.Н. Растрепанный: связь конвергентного расширения с закрытием нервной трубки.Тенденции в неврологии.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).