Благодарим вас за посещение Nature.com.Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Слайдеры, показывающие по три статьи на слайде.Используйте кнопки «Назад» и «Далее» для перемещения по слайдам или кнопки контроллера слайдов в конце для перемещения по каждому слайду.

317 поставщиков колтюбинговых труб из нержавеющей стали

Таблица химического состава материала из нержавеющей стали

SPACA6 представляет собой поверхностный белок, экспрессируемый сперматозоидами, который имеет решающее значение для слияния гамет во время полового размножения млекопитающих.Несмотря на эту фундаментальную роль, конкретная функция SPACA6 плохо изучена.Мы выяснили кристаллическую структуру внеклеточного домена SPACA6 с разрешением 2,2 Å, обнаружив двухдоменный белок, состоящий из четырехцепочечного пучка и Ig-подобных β-сэндвичей, соединенных квазигибкими линкерами.Эта структура напоминает IZUMO1, другой белок, связанный со слиянием гамет, что делает SPACA6 и IZUMO1 членами-основателями суперсемейства белков, связанных с оплодотворением, называемых здесь суперсемейством IST.Суперсемейство IST структурно определяется его скрученным пучком из четырех спиралей и парой мотивов CXXC, связанных дисульфидными связями.Структурный поиск AlphaFold человеческого протеома выявил дополнительные белки-члены этого суперсемейства;в частности, многие из этих белков участвуют в слиянии гамет.Структура SPACA6 и ее связь с другими членами суперсемейства IST представляют собой недостающее звено в наших знаниях о слиянии гамет млекопитающих.
Каждая человеческая жизнь начинается с двух отдельных гаплоидных гамет: спермы отца и яйцеклетки матери.Этот сперматозоид является победителем интенсивного процесса отбора, в ходе которого миллионы сперматозоидов проходят через женские половые пути, преодолевают различные препятствия1 и подвергаются капацитации, что усиливает их подвижность и процесс поверхностных компонентов2,3,4.Даже если сперматозоид и яйцеклетка найдут друг друга, процесс еще не завершен.Ооцит окружен слоем кумулюсных клеток и гликопротеиновым барьером, называемым зоной пеллюцида, через который сперматозоиды должны пройти, чтобы попасть в ооцит.Сперматозоиды используют комбинацию молекул поверхностной адгезии и связанных с мембраной и секретируемых ферментов для преодоления этих окончательных барьеров5.Эти молекулы и ферменты в основном хранятся во внутренней мембране и акросомальном матриксе и обнаруживаются, когда внешняя мембрана сперматозоида лизируется во время акросомальной реакции6.Последним шагом в этом напряженном путешествии является событие слияния сперматозоида и яйцеклетки, в ходе которого две клетки сливают свои мембраны, образуя единый диплоидный организм7.Хотя этот процесс является новаторским в репродукции человека, необходимые молекулярные взаимодействия плохо изучены.
Помимо оплодотворения гамет, широко изучена химия слияния двух липидных бислоев.В общем, слияние мембран — это энергетически невыгодный процесс, который требует, чтобы белковый катализатор претерпел структурные конформационные изменения, которые сближают две мембраны, нарушая их непрерывность и вызывая слияние8,9.Эти белковые катализаторы известны как фузогены и были обнаружены в бесчисленных термоядерных системах.Они необходимы для проникновения вируса в клетки-хозяева (например, gp160 при ВИЧ-1, всплеск у коронавирусов, гемагглютинин у вирусов гриппа)10,11,12 плацентарный (синцитин)13,14,15 и слияния, образующие гаметы, у низших эукариот ( HAP2/GCS1 у растений, простейших и членистоногих) 16,17,18,19.Фузогены для гамет человека еще не открыты, хотя было показано, что несколько белков имеют решающее значение для прикрепления и слияния гамет.Экспрессируемый в ооцитах CD9, трансмембранный белок, необходимый для слияния гамет мыши и человека, был первым обнаружен21,22,23.Хотя его точная функция остается неясной, роль в адгезии, структуре очагов адгезии на микроворсинках яйцеклетки и/или правильной локализации поверхностных белков ооцита кажется вероятной 24,25,26.Двумя наиболее типичными белками, которые имеют решающее значение для слияния гамет, являются белок спермы IZUMO127 и белок ооцита JUNO28, и их взаимная ассоциация является важным шагом в распознавании и адгезии гамет перед слиянием.Самцы мышей с нокаутом Izumo1 и самки мышей Juno с нокаутом полностью стерильны, в этих моделях сперматозоиды попадают в перивителлиновое пространство, но гаметы не сливаются.Аналогично, слияние уменьшалось, когда гаметы обрабатывались антителами против IZUMO1 или JUNO27,29 в экспериментах по экстракорпоральному оплодотворению человека.
Недавно была обнаружена недавно открытая группа белков, экспрессируемых сперматозоидами, фенотипически сходных с IZUMO1 и JUNO20,30,31,32,33,34,35.Белок 6, ассоциированный с акросомальной мембраной сперматозоида (SPACA6), был идентифицирован как необходимый для оплодотворения в крупномасштабном исследовании мутагенеза на мышах.Вставка трансгена в ген Spaca6 приводит к образованию несливающихся сперматозоидов, хотя эти сперматозоиды инфильтрируют перивителлиновое пространство 36 .Последующие исследования нокаута на мышах подтвердили, что Spaca6 необходим для слияния гамет 30,32 .SPACA6 экспрессируется почти исключительно в семенниках и имеет паттерн локализации, сходный с паттерном локализации IZUMO1, а именно внутри интимы сперматозоидов до акросомальной реакции, а затем мигрирует в экваториальную область после акросомальной реакции 30,32.Гомологи Spaca6 существуют у множества млекопитающих и других эукариот 30 и их важность для слияния гамет человека была продемонстрирована ингибированием оплодотворения человека in vitro за счет устойчивости к SPACA6 30 .В отличие от IZUMO1 и JUNO, детали структуры, взаимодействия и функции SPACA6 остаются неясными.
Чтобы лучше понять фундаментальный процесс, лежащий в основе слияния человеческих сперматозоидов и яйцеклеток, что позволит нам получить информацию о будущих разработках в области планирования семьи и лечения бесплодия, мы провели структурные и биохимические исследования SPACA6.Кристаллическая структура внеклеточного домена SPACA6 представляет собой четырехспиральный пучок (4HB) и иммуноглобулиноподобный (Ig-подобный) домен, соединенные квазигибкими областями.Как было предсказано в предыдущих исследованиях,7,32,37 доменная структура SPACA6 аналогична структуре домена IZUMO1 человека, и эти два белка имеют общий необычный мотив: 4HB с треугольной спиральной поверхностью и парой дисульфидно-связанных мотивов CXXC.Мы предполагаем, что IZUMO1 и SPACA6 теперь определяют более крупное, структурно родственное суперсемейство белков, связанных со слиянием гамет.Используя особенности, уникальные для суперсемейства, мы провели исчерпывающий поиск структурного человеческого протеома AlphaFold, идентифицировав дополнительных членов этого суперсемейства, включая нескольких членов, участвующих в слиянии и/или оплодотворении гамет.Теперь выяснилось, что существует общая структурная складка и суперсемейство белков, связанных со слиянием гамет, и наша структура обеспечивает молекулярную карту этого важного аспекта механизма слияния гамет человека.
SPACA6 представляет собой однопроходной трансмембранный белок с одним N-связанным гликаном и шестью предполагаемыми дисульфидными связями (рисунки S1a и S2).Мы экспрессировали внеклеточный домен человеческого SPACA6 (остатки 27–246) в клетках S2 дрозофилы и очистили белок с помощью никелевой аффинной, катионообменной и эксклюзионной хроматографии (рис. S1b).Очищенный эктодомен SPACA6 очень стабилен и гомогенен.Анализ с использованием эксклюзионной хроматографии в сочетании с полигональным светорассеянием (SEC-MALS) выявил один пик с расчетной молекулярной массой 26,2 ± 0,5 кДа (рис. S1c).Это соответствует размеру мономерного эктодомена SPACA6, что указывает на то, что олигомеризация не происходила во время очистки.Кроме того, спектроскопия кругового дихроизма (КД) выявила смешанную α/β-структуру с температурой плавления 51,3 °C (рис. S1d,e).Деконволюция спектров CD выявила 38,6% α-спиральных и 15,8% β-нитевых элементов (рис. S1d).
Эктодомен SPACA6 был кристаллизован с использованием случайного матричного посева38, в результате чего был получен набор данных с разрешением 2,2 Å (Таблица 1 и Рисунок S3).Используя комбинацию молекулярного замещения на основе фрагментов и данных фазировки SAD с воздействием бромида для определения структуры (таблица 1 и рисунок S4), окончательная уточненная модель состоит из остатков 27–246.На момент определения структуры не было доступных экспериментальных структур или структур AlphaFold.Эктодомен SPACA6 имеет размеры 20 Å × 20 Å × 85 Å, состоит из семи спиралей и девяти β-тяжей и имеет удлиненную третичную складку, стабилизированную шестью дисульфидными связями (рис. 1а, б).Слабая электронная плотность на конце боковой цепи Asn243 указывает на то, что этот остаток представляет собой N-связанное гликозилирование.Структура состоит из двух доменов: N-концевого четырехспирального пучка (4HB) и C-концевого Ig-подобного домена с промежуточной шарнирной областью между ними (рис. 1в).
Структура внеклеточного домена SPACA6.Полосовая диаграмма внеклеточного домена SPACA6, цвет цепи от N до С-конца от темно-синего до темно-красного.Цистеины, участвующие в дисульфидных связях, выделены пурпурным цветом.б Топология внеклеточного домена SPACA6.Используйте ту же цветовую схему, что и на рисунке 1а.c Внеклеточный домен SPACA6.Ленточные диаграммы 4HB, шарнирного и Ig-подобного доменов окрашены в оранжевый, зеленый и синий цвета соответственно.Слои прорисовываются не в масштабе.
Домен 4HB SPACA6 включает четыре основные спирали (спирали 1–4), которые расположены в виде винтовой спирали (рис. 2а), чередуя антипараллельные и параллельные взаимодействия (рис. 2б).Перпендикулярно жгуту уложена небольшая дополнительная одновитковая спираль (спираль 1'), образующая треугольник со спиралями 1 и 2. Этот треугольник слегка деформируется в винтово-скрученной упаковке относительно плотной упаковки спиралей 3 и 4 ( рис. 2а).
Ленточная диаграмма N-конца 4HB.б Вид сверху на пучок из четырех спиралей, каждая спираль выделена темно-синим цветом на N-конце и темно-красным на С-конце.c Диаграмма спирального колеса сверху вниз для 4HB, где каждый остаток показан в виде кружка, помеченного однобуквенным кодом аминокислоты;пронумерованы только четыре аминокислоты в верхней части колеса.Неполярные остатки окрашены в желтый цвет, полярные незаряженные остатки — в зеленый цвет, положительно заряженные остатки — в синий цвет, а отрицательно заряженные остатки — в красный цвет.d Треугольные грани домена 4HB: 4HB обозначены оранжевым цветом, а шарниры - зеленым.На обеих вставках видны дисульфидные связи стержнеобразной формы.
4HB сконцентрирован на внутреннем гидрофобном ядре, состоящем в основном из алифатических и ароматических остатков (рис. 2в).Ядро содержит дисульфидную связь между Cys41 и Cys55, которая соединяет спирали 1 и 2 вместе в верхнем приподнятом треугольнике (рис. 2d).Две дополнительные дисульфидные связи образовались между мотивом CXXC в спирали 1' и другим мотивом CXXC, обнаруженным на кончике β-шпильки в шарнирной области (рис. 2d).Консервативный остаток аргинина с неизвестной функцией (Arg37) расположен внутри полого треугольника, образованного спиралями 1', 1 и 2. Алифатические атомы углерода Cβ, Cγ и Cδ Arg37 взаимодействуют с гидрофобным ядром, и его гуанидиновые группы циклически перемещаются. между спиралями 1' и 1 посредством взаимодействия между основной цепью и боковой цепью Thr32 (рис. S5a,b).Tyr34 проходит в полость, оставляя две небольшие полости, через которые Arg37 может взаимодействовать с растворителем.
Ig-подобные β-сэндвич-домены представляют собой большое суперсемейство белков, которые имеют общую особенность: два или более многоцепочечных амфипатических β-листов, взаимодействующих через гидрофобное ядро ​​39. С-концевой Ig-подобный домен SPACA6 имеет ту же структуру. и состоит из двух слоев (рис. С6а).Лист 1 представляет собой β-лист из четырех нитей (нити D, F, H и I), где нити F, H и I образуют антипараллельное расположение, а нити I и D вступают в параллельное взаимодействие.Таблица 2 представляет собой небольшой антипараллельный двухцепочечный бета-лист (нити E и G).Между C-концом E-цепи и центром H-цепи наблюдалась внутренняя дисульфидная связь (Cys170-Cys226) (рис. S6b).Эта дисульфидная связь аналогична дисульфидной связи в β-сэндвич-домене иммуноглобулина40,41.
Четырехнитевой β-лист закручивается по всей длине, образуя асимметричные края, различающиеся по форме и электростатике.Более тонкий край представляет собой плоскую гидрофобную поверхность окружающей среды, которая выделяется на фоне остальных неровных и электростатически разнообразных поверхностей в SPACA6 (рис. S6b,c).Гало обнаженных карбонильных/аминогрупп основной цепи и полярных боковых цепей окружает гидрофобную поверхность (рис. S6c).Более широкий край покрыт спиральным сегментом с колпачком, который блокирует N-концевую часть гидрофобного ядра и образует три водородные связи с открытой полярной группой основной цепи F-цепи (рис. S6d).С-концевая часть этого края образует большой карман с частично обнаженным гидрофобным ядром.Карман окружен положительными зарядами благодаря трем наборам двойных остатков аргинина (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 и Arg212-Arg214) и центральному гистидину (His220) (рис. S6e).
Шарнирная область представляет собой короткий сегмент между спиральным доменом и Ig-подобным доменом, состоящий из одного антипараллельного трехцепочечного β-слоя (нити А, В и С), небольшой спирали 310 и нескольких длинных случайных спиральных сегментов.(Рис. S7).Сеть ковалентных и электростатических контактов в шарнирной области, по-видимому, стабилизирует ориентацию между 4HB и Ig-подобным доменом.Сеть можно разделить на три части.Первая часть включает два мотива CXXC (27CXXC30 и 139CXXC142), которые образуют пару дисульфидных связей между β-шпилькой в ​​шарнире и 1'-спиралью в 4HB.Вторая часть включает электростатические взаимодействия между Ig-подобным доменом и шарниром.Glu132 в шарнире образует солевой мостик с Arg233 в Ig-подобном домене и Arg135 в шарнире.Третья часть включает ковалентную связь между Ig-подобным доменом и шарнирной областью.Две дисульфидные связи (Cys124-Cys147 и Cys128-Cys153) соединяют шарнирную петлю с линкером, который стабилизируется электростатическими взаимодействиями между Gln131 и функциональной группой основной цепи, обеспечивая доступ к первому Ig-подобному домену.цепь.
Структура эктодомена SPACA6 и отдельные структуры 4HB и Ig-подобных доменов были использованы для поиска структурно сходных записей в базах данных белков 42 .Мы определили совпадения с высокими показателями Dali Z, небольшими стандартными отклонениями и большими показателями LALI (последние представляют собой количество структурно эквивалентных остатков).Хотя первые 10 совпадений в результате полного поиска эктодоменов (таблица S1) имели приемлемый Z-показатель> 842, поиск только 4HB или Ig-подобного домена показал, что большинство этих совпадений соответствовали только β-сэндвичам.повсеместная складка, обнаруженная во многих белках.Все три поиска в Дали дали только один результат: IZUMO1.
Уже давно предполагается, что SPACA6 и IZUMO1 имеют структурное сходство7,32,37.Хотя эктодомены этих двух белков, связанных со слиянием гамет, имеют лишь 21% идентичности последовательностей (рис. S8a), сложные доказательства, включая консервативный характер дисульфидных связей и предсказанный C-концевой Ig-подобный домен в SPACA6, позволили сделать ранние попытки создать модель гомологии A — мышь SPACA6 с использованием IZUMO1 в качестве матрицы37.Наша структура подтверждает эти предсказания и показывает истинную степень сходства.Фактически, структуры SPACA6 и IZUMO137,43,44 имеют одну и ту же двухдоменную архитектуру (рис. S8b) со схожими 4HB и Ig-подобными β-сэндвич-доменами, соединенными шарнирной областью (рис. S8c).
IZUMO1 и SPACA6 4HB имеют общие отличия от обычных спиральных жгутов.Типичные 4HB, подобные обнаруженным в белковых комплексах SNARE, участвующих в слиянии эндосом 45,46, имеют равномерно расположенные спирали, поддерживающие постоянную кривизну вокруг центральной оси 47. Напротив, спиральные домены как в IZUMO1, так и в SPACA6 были искажены, с переменной кривизной и неравномерная упаковка (рисунок S8d).Перекрут, вызванный, вероятно, треугольником, образованным спиралями 1', 1 и 2, сохраняется в IZUMO1 и SPACA6 и стабилизируется тем же мотивом CXXC на спирали 1'.Однако дополнительная дисульфидная связь, обнаруженная в SPACA6 (Cys41 и Cys55, ковалентно связывающие спирали 1 и 2 выше), создает более острую вершину на вершине треугольника, что делает SPACA6 более закрученным, чем IZUMO1, с более выраженными треугольниками полостей.Кроме того, у IZUMO1 отсутствует Arg37, наблюдаемый в центре этой полости у SPACA6.Напротив, IZUMO1 имеет более типичное гидрофобное ядро ​​из алифатических и ароматических остатков.
IZUMO1 имеет Ig-подобный домен, состоящий из двухцепочечного и пятицепочечного β-листа43.Дополнительная цепь в IZUMO1 заменяет катушку в SPACA6, которая взаимодействует с цепью F, ограничивая основные водородные связи в цепи.Интересным моментом для сравнения является предсказанный поверхностный заряд Ig-подобных доменов двух белков.Поверхность IZUMO1 более отрицательно заряжена, чем поверхность SPACA6.Дополнительный заряд расположен вблизи С-конца, обращенного к мембране сперматозоида.В SPACA6 те же области были более нейтральными или положительно заряженными (рис. S8e).Например, гидрофобная поверхность (более тонкие края) и положительно заряженные ямки (более широкие края) в SPACA6 заряжены отрицательно в IZUMO1.
Хотя взаимоотношения и элементы вторичной структуры между IZUMO1 и SPACA6 хорошо сохранились, структурное выравнивание Ig-подобных доменов показало, что эти два домена различаются по своей общей ориентации относительно друг друга (рис. S9).Спиральный пучок IZUMO1 изогнут вокруг β-сэндвича, создавая ранее описанную форму «бумеранга» под углом примерно 50° от центральной оси.Напротив, винтовой луч в SPACA6 был наклонен примерно на 10° в противоположном направлении.Различия в этих ориентациях, вероятно, обусловлены различиями в шарнирной области.На уровне первичной последовательности IZUMO1 и SPACA6 имеют небольшое сходство последовательностей в шарнире, за исключением остатков цистеина, глицина и аспарагиновой кислоты.В результате водородные связи и электростатические сети совершенно различны.Элементы вторичной структуры β-листа являются общими для IZUMO1 и SPACA6, хотя цепи в IZUMO1 намного длиннее, а спираль 310 (спираль 5) уникальна для SPACA6.Эти различия приводят к разной ориентации доменов для двух в остальном схожих белков.
Наш поиск на сервере Dali показал, что SPACA6 и IZUMO1 являются единственными двумя экспериментально определенными структурами, хранящимися в базе данных белков, которые имеют эту конкретную складку 4HB (таблица S1).Совсем недавно компания DeepMind (Alphabet/Google) разработала AlphaFold, систему на основе нейронной сети, которая может точно предсказывать трехмерные структуры белков на основе первичных последовательностей48.Вскоре после того, как мы решили структуру SPACA6, была выпущена база данных AlphaFold, предоставляющая модели прогнозируемой структуры, охватывающие 98,5% всех белков в протеоме человека48,49.Используя нашу решенную структуру SPACA6 в качестве модели поиска, поиск структурной гомологии модели в протеоме человека AlphaFold выявил кандидатов с возможным структурным сходством с SPACA6 и IZUMO1.Учитывая невероятную точность AlphaFold в предсказании SPACA6 (рис. S10a) — особенно эктодомена 1,1 Å rms по сравнению с нашей решенной структурой (рис. S10b) — мы можем быть уверены, что идентифицированные совпадения SPACA6, вероятно, будут точными.
Ранее PSI-BLAST искал кластер IZUMO1 с тремя другими белками, связанными со спермой: IZUMO2, IZUMO3 и IZUMO450.AlphaFold предсказал, что эти белки семейства IZUMO сворачиваются в домен 4HB с тем же паттерном дисульфидных связей, что и IZUMO1 (рис. 3a и S11), хотя у них отсутствует Ig-подобный домен.Предполагается, что IZUMO2 и IZUMO3 представляют собой односторонние мембранные белки, подобные IZUMO1, тогда как IZUMO4, по-видимому, секретируется.Функции белков IZUMO 2, 3 и 4 при слиянии гамет не определены.Известно, что IZUMO3 играет роль в биогенезе акросом во время развития сперматозоидов51, а белок IZUMO образует комплекс50.Сохранение белков IZUMO у млекопитающих, рептилий и амфибий предполагает, что их потенциальная функция согласуется с функцией других известных белков, связанных со слиянием гамет, таких как DCST1/2, SOF1 и FIMP.
Схема доменной архитектуры суперсемейства IST: 4HB, шарнирный и Ig-подобный домены выделены оранжевым, зеленым и синим цветом соответственно.IZUMO4 имеет уникальную С-концевую область, которая выглядит черной.Подтвержденные и предполагаемые дисульфидные связи показаны сплошной и пунктирной линиями соответственно.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) и TMEM95 (AlphaFold) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) отображаются в том же цветовом диапазоне, что и панель A. Дисульфидные связи показаны пурпурным цветом.Трансмембранные спирали TMEM95, IZUMO2 и IZUMO3 не показаны.
В отличие от белка IZUMO, другие белки SPACA (т. е. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 и SPACA9) считаются структурно отличными от SPACA6 (рис. S12).Только SPACA9 имеет 4HB, но не ожидается, что он будет иметь ту же параллельно-антипараллельную ориентацию или ту же дисульфидную связь, что и SPACA6.Только SPACA1 имеет аналогичный Ig-подобный домен.AlphaFold предсказывает, что SPACA3, SPACA4 и SPACA5 имеют совершенно другую структуру, чем SPACA6.Интересно, что SPACA4, как известно, также играет роль в оплодотворении, но в большей степени, чем SPACA6, вместо этого облегчая взаимодействие между сперматозоидами и ооцитом zona pellucida52.
Наш поиск AlphaFold нашел еще одно совпадение для IZUMO1 и SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, единственный трансмембранный белок, специфичный для сперматозоидов, делает мышей-самцов бесплодными при удалении 32,33.Сперматозоиды, лишенные TMEM95, имели нормальную морфологию, подвижность и способность проникать в пеллюцидную зону и связываться с мембраной яйцеклетки, но не могли сливаться с мембраной ооцита.Предыдущие исследования показали, что TMEM95 имеет структурное сходство с IZUMO133.Действительно, модель AlphaFold подтвердила, что TMEM95 представляет собой 4HB с той же парой мотивов CXXC, что и IZUMO1 и SPACA6, и той же дополнительной дисульфидной связью между спиралями 1 и 2, обнаруженной в SPACA6 (рис. 3a и S11).Хотя в TMEM95 отсутствует Ig-подобный домен, он имеет область с паттерном дисульфидных связей, аналогичную шарнирным областям SPACA6 и IZUMO1 (рис. 3b).На момент публикации этой рукописи сервер препринтов сообщил о структуре TMEM95, подтвердив результат AlphaFold53.TMEM95 очень похож на SPACA6 и IZUMO1 и эволюционно консервативен уже у амфибий (рис. 4 и S13).
В поиске PSI-BLAST использовались базы данных NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP и SOF1 для определения положения этих последовательностей в древе жизни.Расстояния между точками ветвления показаны не в масштабе.
Поразительное общее структурное сходство между SPACA6 и IZUMO1 позволяет предположить, что они являются членами консервативного структурного суперсемейства, которое включает белки TMEM95 и IZUMO 2, 3 и 4.известные члены: IZUMO1, SPACA6 и TMEM95.Поскольку только несколько членов обладают Ig-подобными доменами, отличительной чертой суперсемейства IST является домен 4HB, который имеет уникальные особенности, общие для всех этих белков: 1) Спиральный 4HB со спиралями, расположенными в антипараллельном/параллельном чередовании (рис. .5а), 2) пучок имеет треугольную грань, состоящую из двух спиралей внутри пучка и третьей вертикальной спирали (рис. ключевая область (рис. 5в). Известно, что мотив CXXC, обнаруженный в тиоредоксин-подобных белках, функционирует в качестве окислительно-восстановительного сенсора 54,55,56, в то время как мотив у членов семейства IST может быть связан с белковыми дисульфидными изомеразами, такими как ERp57 при слиянии гамет.
Члены суперсемейства IST определяются тремя характерными особенностями домена 4HB: четырьмя спиралями, чередующимися между параллельной и антипараллельной ориентацией, ba-треугольными гранями спирального пучка и двойным мотивом ca CXXC, образующимся между небольшими молекулами.) N-концевые спирали (оранжевые) и шарнирная область β-шпильки (зеленые).
Учитывая сходство SPACA6 и IZUMO1, была протестирована способность первого связываться с IZUMO1 или JUNO.Биослойная интерферометрия (BLI) — это кинетический метод связывания, который ранее использовался для количественной оценки взаимодействия между IZUMO1 и JUNO.После инкубации меченного биотином сенсора с IZUMO1 в качестве приманки с высокой концентрацией аналита JUNO был обнаружен сильный сигнал (рис. S14a), указывающий на вызванное связыванием изменение толщины биоматериала, прикрепленного к кончику сенсора.Аналогичные сигналы (т. е. JUNO, подключенный к датчику в качестве приманки против аналита IZUMO1) (рис. S14b).Никакого сигнала не было обнаружено, когда SPACA6 использовался в качестве аналита против связанного с датчиком IZUMO1 или связанного с датчиком JUNO (рис. S14a,b).Отсутствие этого сигнала указывает на то, что внеклеточный домен SPACA6 не взаимодействует с внеклеточным доменом IZUMO1 или JUNO.
Поскольку анализ BLI основан на биотинилировании свободных остатков лизина на белке-приманке, эта модификация может предотвратить связывание, если во взаимодействии участвуют остатки лизина.Кроме того, ориентация связывания относительно сенсора может создавать стерические препятствия, поэтому обычные анализы с вытягиванием также были выполнены на рекомбинантных эктодоменах SPACA6, IZUMO1 и JUNO.Несмотря на это, SPACA6 не осаждался с IZUMO1, меченным His, или JUNO, меченным His (рис. S14c, d), что указывает на отсутствие взаимодействия, соответствующего тому, которое наблюдалось в экспериментах BLI.В качестве положительного контроля мы подтвердили взаимодействие JUNO с меченым His IZUMO1 (рисунки S14e и S15).
Несмотря на структурное сходство SPACA6 и IZUMO1, неспособность SPACA6 связывать JUNO неудивительна.Поверхность IZUMO1 человека имеет более 20 остатков, взаимодействующих с JUNO, включая остатки из каждой из трех областей (хотя большинство из них расположены в шарнирной области) (рис. S14f).Из этих остатков только один консервативен в SPACA6 (Glu70).Хотя многие замены остатков сохранили свои первоначальные биохимические свойства, существенный остаток Arg160 в IZUMO1 был заменен отрицательно заряженным Asp148 в SPACA6;предыдущие исследования показали, что мутация Arg160Glu в IZUMO1 почти полностью устраняет связывание с JUNO43.Кроме того, разница в ориентации доменов между IZUMO1 и SPACA6 значительно увеличивала площадь поверхности сайта связывания JUNO эквивалентной области на SPACA6 (рис. S14g).
Несмотря на известную необходимость SPACA6 для слияния гамет и его сходство с IZUMO1, SPACA6, по-видимому, не имеет эквивалентной функции связывания JUNO.Поэтому мы попытались объединить наши структурные данные с важными доказательствами, предоставленными эволюционной биологией.Выравнивание последовательностей гомологов SPACA6 показывает сохранение общей структуры за пределами млекопитающих.Например, остатки цистеина присутствуют даже у отдаленно родственных амфибий (рис. 6а).С помощью сервера ConSurf данные сохранения множественного выравнивания последовательностей для 66 последовательностей были сопоставлены с поверхностью SPACA6.Этот тип анализа может показать, какие остатки были законсервированы в ходе эволюции белка, и указать, какие области поверхности играют роль в функции.
Выравнивание последовательностей эктодоменов SPACA6 12 различных видов, полученных с использованием CLUSTAL OMEGA.Согласно анализу ConSurf, наиболее консервативные позиции отмечены синим цветом.Остатки цистеина выделены красным.Границы доменов и элементы вторичной структуры показаны вверху выравнивания, где стрелки указывают на β-тяжи, а волны указывают на спирали.Идентификаторами доступа NCBI, содержащими последовательности, являются: человек (Homo sapiens, NP_001303901), мандрил (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), обезьяна-капуцин (Cebus mimic, XP_017359366), лошадь (Equus caballus, XP_023506102), косатка (Orcinus orca3_23 XP). _032_034) .), овца (Ovis aries, XP_014955560), слон (Loxodonta africana, XP_010585293), собака (Canis lupus Familyis, XP_025277208), мышь (Mus musculus, NP_001156381), тасманский дьявол (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), утконос с, 8) , 61_89 и Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Нумерация основана на человеческом порядке.b Поверхностное представление структуры SPACA6 с 4HB вверху и Ig-подобным доменом внизу, цвета основаны на оценках сохранения с сервера ConSurf.Наиболее сохранившиеся части выделены синим цветом, умеренно сохранившиеся — белым, а наименее сохранившиеся — желтым.фиолетовый цистеин.Три поверхностных пластыря, демонстрирующие высокий уровень защиты, показаны на вставке, обозначенной как патчи 1, 2 и 3. На вставке вверху справа показан рисунок 4HB (та же цветовая схема).
Структура SPACA6 имеет три высококонсервативных поверхностных участка (рис. 6б).Патч 1 охватывает 4HB и шарнирную область и содержит два консервативных дисульфидных мостика CXXC, шарнирную сеть Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (рис. S7) и три консервативных внешних ароматических остатка (Phe31, Tyr73, Phe137)).более широкий ободок Ig-подобного домена (рис. S6e), который представляет собой несколько положительно заряженных остатков на поверхности сперматозоидов.Интересно, что этот пластырь содержит эпитоп антитела, которое, как ранее было показано, мешает функции SPACA6 30.Область 3 охватывает шарнир и одну сторону Ig-подобного домена;эта область содержит консервативные пролины (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) и обращенные наружу полярные/заряженные остатки.Удивительно, но большинство остатков на поверхности 4HB сильно вариабельны (рис. 6b), хотя складка консервативна во всем гомологе SPACA6 (на что указывает консервативность гидрофобного ядра пучка) и за пределами суперсемейства IST.
Хотя это самая маленькая область в SPACA6 с наименьшим количеством обнаруживаемых элементов вторичной структуры, многие остатки шарнирной области (включая область 3) высококонсервативны среди гомологов SPACA6, что может указывать на то, что ориентация спирального пучка и β-сэндвича играет роль.как консерватор.Однако, несмотря на обширные водородные связи и электростатические сети в шарнирной области SPACA6 и IZUMO1, доказательства внутренней гибкости можно увидеть в выравнивании множественных разрешенных структур IZUMO137,43,44.Выравнивание отдельных доменов хорошо перекрывалось, но ориентация доменов относительно друг друга варьировалась от 50° до 70° от центральной оси (рис. S16).Чтобы понять конформационную динамику SPACA6 в растворе, были проведены эксперименты SAXS (рис. S17a,b).Ab initio реконструкция эктодомена SPACA6 соответствовала стержневой кристаллической структуре (рис. S18), хотя график Кратки показал некоторую степень гибкости (рис. S17b).Эта конформация контрастирует с IZUMO1, в которой несвязанный белок принимает форму бумеранга как в решетке, так и в растворе43.
Чтобы конкретно идентифицировать гибкую область, на SPACA6 была проведена водородно-дейтериевая обменная масс-спектроскопия (H-DXMS) и сравнена с данными, полученными ранее на IZUMO143 (рис. 7a,b).SPACA6 явно более гибок, чем IZUMO1, о чем свидетельствует более высокий обмен дейтерия по всей структуре после 100 000 с обмена.В обеих структурах С-концевая часть шарнирной области демонстрирует высокий уровень обмена, что, вероятно, обеспечивает ограниченное вращение 4HB и Ig-подобных доменов относительно друг друга.Интересно, что С-концевая часть шарнира SPACA6, состоящая из остатка 147CDLPLDCP154, представляет собой высококонсервативную область 3 (рис. 6б), что, возможно, указывает на то, что междоменная гибкость является эволюционно консервативной особенностью SPACA6.Согласно анализу гибкости, данные термического плавления CD показали, что SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) менее стабилен, чем IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) (рис. S1e и S19).
a H-DXMS-изображения SPACA6 и b IZUMO1.Процент дейтериевого обмена определяли в указанные моменты времени.Уровни водородно-дейтериевого обмена обозначены цветом по градиентной шкале от синего (10%) до красного (90%).Черные ящики представляют собой области активного обмена.Границы 4HB, шарнирного и Ig-подобного домена, наблюдаемые в кристаллической структуре, показаны над первичной последовательностью.Уровни дейтериевого обмена через 10, 1000 и 100 000 с были нанесены на ленточную диаграмму, наложенную на прозрачные молекулярные поверхности SPACA6 и IZUMO1.Части конструкций с уровнем дейтериевого обмена ниже 50% окрашены в белый цвет.Области с обменом H-DXMS выше 50% окрашены в градиентную шкалу.
Использование CRISPR/Cas9 и генетических стратегий нокаута генов мышей привело к идентификации нескольких факторов, важных для связывания и слияния сперматозоидов и яйцеклеток.Помимо хорошо изученного взаимодействия структуры IZUMO1-JUNO и CD9, большинство белков, связанных со слиянием гамет, остаются структурно и функционально загадочными.Биофизические и структурные характеристики SPACA6 являются еще одной частью молекулярной головоломки адгезии/слияния во время оплодотворения.
SPACA6 и другие члены суперсемейства IST, по-видимому, высоко консервативны у млекопитающих, а также у отдельных птиц, рептилий и амфибий;на самом деле, считается, что SPACA6 даже необходим для оплодотворения у рыбок данио 59. Это распределение похоже на другие известные белки, связанные со слиянием гамет, такие как DCST134, DCST234, FIMP31 и SOF132, что позволяет предположить, что эти факторы дефицитны по HAP2 (также известные как GCS1), белки, которые отвечают за каталитическую активность многих простейших., растения и членистоногие.Оплодотворенные слитые белки 60, 61. Несмотря на сильное структурное сходство между SPACA6 и IZUMO1, нокаут генов, кодирующих любой из этих белков, приводил к бесплодию у самцов мышей, указывая на то, что их функции при слиянии гамет не дублируются..В более широком смысле, ни один из известных белков сперматозоидов, необходимых для адгезионной фазы слияния, не является избыточным.
Остается открытым вопрос, участвуют ли SPACA6 (и другие члены суперсемейства IST) в межгаметных соединениях, образуют внутригаметные сети для рекрутирования важных белков в точки слияния или, возможно, даже действуют как неуловимые фузогены.Исследования коиммунопреципитации в клетках HEK293T выявили взаимодействие между полноразмерным IZUMO1 и SPACA632.Однако наши рекомбинантные эктодомены не взаимодействовали in vitro, что позволяет предположить, что взаимодействия, наблюдаемые у Noda et al.оба были удалены в конструкции (обратите внимание на цитоплазматический хвост IZUMO1, который, как было показано, не нужен для оплодотворения62).Альтернативно, IZUMO1 и/или SPACA6 могут требовать специфической среды связывания, которую мы не воспроизводим in vitro, например, физиологически специфических конформаций или молекулярных комплексов, содержащих другие белки (известные или еще не открытые).Хотя считается, что эктодомен IZUMO1 обеспечивает прикрепление сперматозоидов к яйцеклетке в перивителлиновом пространстве, назначение эктодомена SPACA6 неясно.
В структуре SPACA6 обнаружено несколько консервативных поверхностей, которые могут участвовать в белок-белковых взаимодействиях.Консервативная часть шарнирной области, непосредственно примыкающая к мотиву CXXC (обозначенная выше «Участок 1»), имеет несколько обращенных наружу ароматических остатков, которые часто связаны с гидрофобными и π-стекинговыми взаимодействиями между биомолекулами.Широкие стороны Ig-подобного домена (область 2) образуют положительно заряженную бороздку с высококонсервативными остатками Arg и His, а антитела против этой области ранее использовались для блокирования слияния гамет 30 .Антитело распознает линейный эпитоп 212RIRPAQLTHRGTFS225, который содержит три из шести остатков аргинина и высококонсервативный His220.Неясно, вызвана ли дисфункция блокировкой этих конкретных остатков или всей области.Расположение этого разрыва вблизи С-конца β-сэндвича указывает на цис-взаимодействия с соседними белками спермы, но не с белками ооцита.Более того, сохранение очень гибкого, богатого пролином клубка (сайт 3) внутри шарнира может быть местом белок-белкового взаимодействия или, что более вероятно, указывать на сохранение гибкости между двумя доменами.Пол важен для неизвестной роли SPACA6.слияние гамет.
SPACA6 обладает свойствами белков межклеточной адгезии, включая Ig-подобные β-сэндвичи.Многие адгезивные белки (например, кадгерины, интегрины, адгезины и IZUMO1) обладают одним или несколькими β-сэндвич-доменами, которые распространяют белки от клеточной мембраны к их мишеням из окружающей среды63,64,65.Ig-подобный домен SPACA6 также содержит мотив, обычно встречающийся в β-сэндвичах адгезии и когезии: дублеты параллельных нитей на концах β-сэндвичей, известные как механические зажимы66.Считается, что этот мотив повышает устойчивость к силам сдвига, что ценно для белков, участвующих в межклеточных взаимодействиях.Однако, несмотря на это сходство с адгезинами, в настоящее время нет доказательств того, что SPACA6 взаимодействует с яичными белками.Эктодомен SPACA6 не способен связываться с JUNO, а SPACA6-экспрессирующие клетки HEK293T, как показано здесь, почти не взаимодействуют с ооцитами, лишенными зоны 32 .Если SPACA6 действительно устанавливает межгаметные связи, эти взаимодействия могут потребовать посттрансляционных модификаций или стабилизации с помощью других белков спермы.В подтверждение последней гипотезы, IZUMO1-дефицитные сперматозоиды связываются с ооцитами, демонстрируя, что молекулы, отличные от IZUMO1, участвуют в стадии адгезии гамет 27 .
Многие вирусные, клеточные и слитые белки развития обладают свойствами, которые предсказывают их функцию фузогенов.Например, слитые вирусные гликопротеины (классы I, II и III) имеют гидрофобный слитый пептид или петлю на конце белка, который встраивается в мембрану хозяина.Карта гидрофильности IZUMO143 и структура (определенная и предсказанная) суперсемейства IST не выявили явного гидрофобного слитого пептида.Таким образом, если какие-либо белки суперсемейства IST функционируют как фузогены, то они делают это способом, отличным от других известных примеров.
В заключение отметим, что функции членов суперсемейства белков IST, связанных со слиянием гамет, остаются загадкой.Наша охарактеризованная рекомбинантная молекула SPACA6 и ее определенная структура дадут представление о взаимоотношениях между этими общими структурами и их роли в прикреплении и слиянии гамет.
Последовательность ДНК, соответствующая предсказанному эктодомену SPACA6 человека (инвентарный номер NCBI NP_001303901.1; остатки 27–246), была оптимизирована по кодонам для экспрессии в клетках S2 Drosophila melanogaster и синтезирована в виде фрагмента гена с последовательностью, кодирующей Kozak (Eurofins Genomics).сигнал секреции BiP и соответствующие 5'- и 3'-концы для независимого от лигирования клонирования этого гена в вектор экспрессии pMT на основе металлотионеинового промотора, модифицированного для селекции пуромицином (pMT-puro).Вектор pMT-puro кодирует сайт расщепления тромбина, за которым следует С-концевая метка 10x-His (рис. S2).
Стабильную трансфекцию вектора SPACA6 pMT-puro в клетки D. melanogaster S2 (Gibco) проводили аналогично протоколу, использованному для IZUMO1 и JUNO43.Клетки S2 размораживали и выращивали в среде Шнайдера (Gibco) с добавлением в конечной концентрации 10% (об./об.) термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (Gibco) и 1X антимикотического антибиотика (Gibco).Клетки раннего пассажа (3,0×106 клеток) высевали в отдельные лунки 6-луночных планшетов (Corning).Через 24 часа инкубации при 27°С клетки трансфицировали смесью 2 мг вектора SPACA6 pMT-puro и реагента для трансфекции Effectene (Qiagen) согласно протоколу производителя.Трансфицированные клетки инкубировали в течение 72 часов, а затем собирали с пуромицином в концентрации 6 мг/мл.Затем клетки выделяли из полной среды Шнайдера и помещали в бессывороточную среду Insect-XPRESS (Lonza) для крупномасштабного производства белка.Партию культуры клеток S2 объемом 1 л выращивали до 8–10 × 106 мл-1 клеток в вентилируемой плоскодонной полипропиленовой колбе Эрленмейера емкостью 2 л, а затем стерилизовали конечной концентрацией 500 мкМ CuSO4 (Millipore Sigma) и стерильно фильтровали.индуцированный.Индуцированные культуры инкубировали при 27°С и скорости 120 об/мин в течение четырех дней.
Кондиционированную среду, содержащую SPACA6, выделяли центрифугированием при 5660×g при 4°C с последующим использованием системы тангенциальной проточной фильтрации Centramate (Pall Corp) с мембраной MWCO 10 кДа.Нанесите концентрированную среду, содержащую SPACA6, на колонку с агарозной смолой Ni-NTA (Qiagen) емкостью 2 мл.Смолу Ni-NTA промывали 10 объемами колонки (CV) буфера A, а затем добавляли 1 CV буфера A, чтобы получить конечную концентрацию имидазола 50 мМ.SPACA6 элюировали 10 мл буфера А с добавлением имидазола до конечной концентрации 500 мМ.Тромбин класса рестрикции (Millipore Sigma) добавляли непосредственно в диализную трубку (MWCO 12-14 кДа) в количестве 1 единицы на мг SPACA6 по сравнению с 1 л 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5 и 150 мМ NaCl (буфер B) для диализа.) при 4°C в течение 48 часов.Расщепленный тромбином SPACA6 затем разбавляли в три раза для снижения концентрации соли и загружали в катионообменную колонку MonoS 5/50 GL объемом 1 мл (Cytiva/GE), уравновешенную 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5.Катионит промывали 3 ОК 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, затем SPACA6 элюировали с линейным градиентом от 0 до 500 мМ NaCl в 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5 в течение 25 ОК.После ионообменной хроматографии SPACA6 концентрировали до 1 мл и изократически элюировали из колонки ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad), уравновешенной буфером B. Согласно хроматограмме объединяли и концентрировали фракции, содержащие SPACA6.Чистоту контролировали электрофорезом с окрашиванием Кумасси в 16%-ном ДСН-полиакриламидном геле.Концентрацию белка определяли количественно по поглощению при 280 нм с использованием закона Бера-Ламберта и теоретического молярного коэффициента экстинкции.
Очищенный SPACA6 диализовали в течение ночи против 10 мМ фосфата натрия, pH 7,4 и 150 мМ NaF и разбавляли до 0,16 мг/мл перед анализом методом КД-спектроскопии.Спектральное сканирование компакт-дисков с длиной волны от 185 до 260 нм собирали на спектрополяриметре Jasco J-1500 с использованием кварцевых кювет с длиной оптического пути 1 мм (Helma) при 25°С со скоростью 50 нм/мин.Спектры КД были скорректированы по базовой линии, усреднены по 10 регистрациям и преобразованы в среднюю остаточную эллиптичность (θMRE) в градусах см2/дмоль:
где MW – молекулярная масса каждого образца в Да;N – количество аминокислот;θ — эллиптичность в миллиградусах;d соответствует длине оптического пути в см;концентрация белка в единицах.